魚類Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因系統進化及其在有/無肌間骨代表魚中的表達比較分析

廖 青 萬世明 王旭東 高澤霞 ,

(1.華中農業大學水產學院, 農業農村部淡水生物繁育重點實驗室/農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室, 武漢 430070;2.長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心, 武漢 430070; 3.湖北省名優魚育種與健康養殖工程技術研究中心, 武漢 430070)

肌間骨(Intermuscular Bone, IB), 俗稱肌間刺、魚刺, 是由魚類肌膈結締組織連續同源骨化而來的膜骨[1], 根據自身直接或間接附著的位置可分為椎體小骨、髓弓小骨和脈弓小骨三種類型[2,3]。肌間骨僅存在于低等真骨魚類中, 在系統演化過程中表現出數目由少到多, 由多到少再到無的特征[3—5]。魚類肌間骨相關研究早在20世紀60年代便已開展[6],但多數研究集中在肌間骨發育及形態方面。近年來, 研究人員逐步開展了肌間骨發生發育分子調控機制方面的研究。Wan等[7]通過構建團頭魴肌間骨mRNA與miRNA組學數據庫, 揭示了大量肌間骨發育的潛在調控基因[8,9]及其數目相關的SNP分子標記。陳宇龍等[10]發現tnmd基因對肌間骨的形成具有一定調控作用, Nie等[11]研究發現肌間骨的骨化類型為膜內骨化, Zhang等[12]發現骨形態發生蛋白(BMPs)家族基因對肌間骨的發育具有潛在調控作用。但總體來講, 基因與肌間骨發生發育的關聯性研究還非常缺乏。

膠原蛋白(Collagen)家族成員眾多, 功能多樣。其中, Ⅰ型膠原蛋白(Collagen type Ⅰ, COLⅠ)是骨細胞外基質的主要成分, 由col1a1和col1a2基因編碼。Ⅱ型膠原多分布于骨骼和關節等組織, 由col2a1基因編碼。哺乳動物中相關研究表明Ⅰ型和Ⅱ型膠原參與骨骼的礦化和生長過程[13—16]。在魚類中, 膠原蛋白基因在骨骼發育中的表達調控作用也已被報道, 如col1a1在骨骼畸形的金頭鯛(Sparus aurata)中表達下調[17],col10a1的表達在青鳉(Oryzias latipes)中標志著成骨細胞的早期階段[18]等;Gistelinck等[19]以斑馬魚為模型研究了大量Ⅰ型膠原突變體的骨骼表型, 包括愈傷組織形成和肋骨彎曲等。但截至目前, 膠原蛋白在肌間骨發生發育過程中的表達調控作用還未知。

團頭魴(Megalobrama amblycephala)隸屬于鯉形目(Cypriniformes), 鯉科(Cyprinidae), 鲌亞科(Culterinae), 魴屬(Megalobrama), 是我國特有的重要草食性經濟魚類之一[20]。團頭魴包含軸上肌中的髓弓小骨和尾部軸下肌中的脈弓小骨兩種肌間骨, 其成年個體的肌間骨形態較為復雜。孵出后20d左右, 團頭魴幼魚出現第一根肌間骨; 孵出后40d左右肌間骨基本完全出現; 之后隨著魚體的生長, 肌間骨的形態不斷分化復雜[21]。尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)生長速度快, 肉質鮮美, 是世界上僅次于鯉的主要養殖魚類, 也是我國主要養殖魚類之一[22]。羅非魚背部和尾部肌肉中均無肌間骨的存在[23], 即羅非魚無髓弓小骨和脈弓小骨。因此, 這兩種魚類可作為探究魚類肌間骨發生發育分子機制的比較模型。為探究膠原蛋白基因表達模式與魚類肌間骨發育的相關性, 本研究以有肌間骨的團頭魴和無肌間骨的尼羅羅非魚為研究對象, 探究有刺魚和無刺魚Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因的系統進化特征, 并進一步分析了Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因在個體不同發育階段以及不同部位肌肉組織中的表達模式, 為發掘硬骨魚類肌間骨形成的潛在分子調控提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用團頭魴1齡樣本和出膜幼苗均來自湖北百容良種有限公司; 尼羅羅非魚1齡樣本購自海南水產品市場, 出膜幼苗由廣東海大集團友情提供。為測定Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白在不同組織中的轉錄水平, 隨機抽取3尾1齡團頭魴[平均體重(143.23±53.77) g], 3尾1齡尼羅羅非魚[平均體重(775.23±26.88) g], 用MS-222麻醉后解剖, 每個標本采集背上肌、尾上肌和尾下肌組織樣品(包含肌間骨)。對于5—60 dph(Days post hatching, dph)的團頭魴和尼羅羅非魚幼魚, 使用MS-222麻醉后, 采集尾部肌肉,采樣周期為5d。所有組織在采樣后立即用液氮冷凍, 然后轉入-80℃冰箱保存待用。

1.2 Total RNA提取及cDNA合成

用Trizol法(TaKaRa, 大連)從-80℃凍存的肌肉樣品中提取Total RNA, 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。使用 NanoDrop ND-2000核酸蛋白儀(Thermo, 美國)測定RNA濃度及質量。參照HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix(Vazyme Biotech Co.,Ltd., Nanjing, China)試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA后, 于-80℃凍存備用。

1.3 Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因的克隆

Ensembl上下載斑馬魚col1a1a(ENSDART0000 0009393.6)、col1a1b(ENSDART00000015092.9)、col1a2(ENSDART00000042990.4)和col2a1b(ENSDART00000047844)的cDNA序列, 與課題組之前已獲得的團頭魴尾部肌肉轉錄組序列[24]進行blast比對, 獲得團頭魴col1a1a(MN580510)、col1a1b(MN 580511)和col1a2(MN580512)的完整CDS序列和col2a1b基因的部分CDS序列。利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計, 送北京擎科生物科技有限公司武漢分公司合成(表1), 以轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增。用1%瓊脂糖檢測產物質量后, 將條帶單一的PCR產物送往武漢擎科生物技術有限公司測序。將測序獲得的目的基因片段與已知片段比對拼接, 獲得團頭魴col2a1b(MN580514)的完整CDS序列。尼羅羅非魚col1a1(ENSONIT00000008 027.1)、col1a2(ENSONIT00000013579.1)和col2a1b(ENSONIT00000006473.1)的CDS序列直接從Ensembl數據庫下載獲得。

表1 團頭魴col2a1b基因克隆相關引物信息Tab.1 Primers used for col2a1b gene clone

1.4 Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因的同源性分析

使用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線預測基因開放閱讀框, 使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白的理化性質。用DNAMAN軟件比較尼羅羅非魚和團頭魴col1a1(a/b)、col1a2、col2a1b基因的相似度。使用NCBI BLAST查找并下載與目的基因同源性較高的序列, 使用MEGA7.0軟件構建系統進化樹。

1.5 Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因定量表達分析

參照已獲得的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因的序列信息, 以β-actin為內參基因, 設計定量引物(表2), 送武漢擎科生物技術有限公司合成。以團頭魴和尼羅羅非魚不同發育時期樣品和1齡魚不同組織樣品cDNA為模板, 參照試劑盒Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)(翊圣, 上海)說明進行qRT-PCR反應。采用2-ΔΔCt法進行轉錄本相對表達水平計算。使用SPSS軟件及Duncan’s Multiple Range Test來比較基因在幼魚不同發育時期及不同組織中的相對表達水平。

表2 基因qRT-PCR相關引物信息Tab.2 Primes used for qRT-PCR

2 結果

2.1 基因克隆及基因理化性質分析

基于序列同源性, 使用斑馬魚和草魚基因序列克隆拼接了團頭魴Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白序列, 并在線驗證開放閱讀框的完整性。最終獲得團頭魴Ⅰ型膠原蛋白col1a1a、col1a1b、col1a2及Ⅱ型膠原蛋白col2a1b的核心序列。其CDS序列長度依次為4347、4353、4059和3741 bp, 分別編碼1448、1450、1352和1246個氨基酸。使用ProtParam 軟件對基因進行理化性質分析(表3)。

2.2 基因同源性分析

使用DNAMAN對人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、雞(Gallus gallus)、豬(Sus scrofa)、羊(Ovis aries)、團頭魴(M.amblycephala)及其他魚類的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因的氨基酸序列進行比較,并使用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。結果顯示,團頭魴與斑馬魚4個基因的氨基酸相似度分別達到了94.23%(col1a1a)、90.46%(col1a1b)、93.32%(col1a2)和84.77%(col2a1b), 序列同源性較高(圖1)。團頭魴和尼羅羅非魚基因的氨基酸比對結果顯示:團頭魴col1a1a、col1a1b和尼羅羅非魚col1a1三個基因的氨基酸相似度為83.39%, 團頭魴col1a1a較尼羅羅非魚col1a1的序列插入了157個氨基酸, 團頭魴col1a1b較尼羅羅非魚col1a1的序列插入了159個氨基酸; 團頭魴與尼羅羅非魚的col1a2的氨基酸序列相似度為67.38%, 團頭魴較尼羅羅非魚的col1a2序列插入了272個氨基酸; 團頭魴與尼羅羅非魚col2a1b的序列相似度為74.8%, 團頭魴較尼羅羅非魚存在245個氨基酸的缺失(圖1)。Ⅰ型和Ⅱ型膠原的系統進化樹顯示魚類與哺乳類和家禽類的遺傳距離比較遠, 形成2個大分支。在魚類大分支中, 針對有無髓弓小骨和脈弓小骨, 4個基因的系統進化分析都顯示團頭魴、草魚和斑馬魚等有刺魚聚在一支, 而尼羅羅非魚、半滑舌鰨和青鳉等無刺魚聚在一支(圖2)。

2.3 基因在不同組織的差異表達分析

以1齡團頭魴和1齡尼羅羅非魚為材料, 采用qRT-PCR方法分析col1a1(a/b)、col1a2和col2a1b在軀體不同部位肌肉組織中的表達情況, 結果顯示:Ⅰ型膠原蛋白(col1a1和col1a2)在團頭魴背部、尾部上方及尾部下方中的表達量依次下降, 在羅非魚中則呈先上升后下降趨勢(圖3A和3B)。團頭魴col1a1a的表達水平顯著高于col1a1b,col1a1a在團頭魴背部、尾部上方及尾部下方肌肉中的表達量依次顯著降低(P＜0.01),col1a1b的表達則無顯著性差異(P＞0.05)。羅非魚col1a1在尾上側肌肉中的表達量高于背側肌肉中的表達量, 但二者無顯著性差異(P＞0.05)。團頭魴與羅非魚col1a2基因的表達模式與col1a1類似, 兩種魚類col1a2在背上肌肉與尾上側肌肉中的表達量高低相反, 而在尾部上方與尾部下方肌肉中的表達量均顯著性(P＜0.01)下降。此外, 表達分析結果表明col2a1b在團頭魴背部、尾部上方及尾部下方肌肉中的表達量依次降低, 在羅非魚相應部位的表達量則依次升高(圖3C)。團頭魴尾部上方與尾部下方肌肉中col2a1b的表達無顯著差異(P＞0.05), 背部肌肉中的高表達量與尾部肌肉中的低表達量有極顯著差異(P＜0.01); 而羅非魚col2a1b在三個部位的肌肉中的表達依次顯著升高(P＜0.05)。此外, 結果還表明Ⅰ型膠原蛋白基因在團頭魴(col1a1a和col1a1b)各部位肌肉組織中的表達量波動幅度都高于羅非魚(col1a1, 圖3A)。

2.4 膠原蛋白基因在不同發育階段的表達分析

本研究采用qRT-PCR方法分析了目標基因在團頭魴和尼羅羅非魚5—60 dph的表達變化。如圖4所示, 團頭魴col1a1a從5—15 dph的表達呈上升趨勢, 在20—40 dph表達量降至極低且無顯著差異(P＞0.05), 而在50 dph左右表達量又出現極顯著(P＜0.01)上升, 60 dph時表達量降低但仍在較高水平;col1a1b基因在各階段的表達水平相對較低且較為穩定, 各階段之間無顯著差異(P＞0.05),col1a1b在15、50及60 dph的表達量顯著低于col1a1a(P＜0.01)。尼羅羅非魚col1a1的表達呈先上升后下降再回升的趨勢, 從15 dph左右開始極顯著(P＜0.01)上升, 在30 dph左右達到峰值, 40 dph左右表達量開始逐漸降低, 60 dph時表達水平又開始回升。在尼羅羅非魚10—60 dph的發育過程中, 連續的每2個階段間均有極顯著差異(P＜0.01)。團頭魴col1a1a基因在15、50和60 dph的表達都比羅非魚col1a1基因在對應時期的表達更為活躍。團頭魴的col1a1a在15、50及60 dph表達豐度極高, 表達量為相鄰階段的數十倍, 與其余各階段均有極顯著差異(P＜0.01);尼羅羅非魚的col1a1在15和60 dph左右表達上升,變化幅度較小, 但與相鄰階段依然有極顯著差異(P＜0.01)。

表3 團頭魴Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白基因的理化性質Tab.3 Physicochemical properties of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes in M.amblycephala

圖1 團頭魴與尼羅羅非魚Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of amino acids of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes in M.amblycephala and O.niloticus

圖2 Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白基因系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes

團頭魴和尼羅羅非魚不同生長階段的col1a2在尾部肌肉中的表達模式非常相似, 整體呈先上升后下降, 再回升的趨勢(圖5)。團頭魴col1a2的表達在5—30 dph呈逐漸上升趨勢, 到30 dph左右極顯著(P＜0.01)上升到達峰值, 30—60 dph的表達為先下降后上升再下降的過程, 相鄰階段間的變化均有極顯著(P＜0.01)差異。尼羅羅非魚在5—30 dph呈上升趨勢, 從15 dph開始極顯著(P＜0.01)上升, 到25 dph左右表達水平達到最高, 25與30 dph的表達無顯著差異(P＞0.05); 30—60 dph的表達為先下降后上升的過程, 相鄰階段間的變化均有極顯著(P＜0.01)差異。此外,col1a2基因在團頭魴多個階段的表達都比羅非魚對應階段更加活躍。

如圖6所示, 團頭魴在尾部肌肉不同發育階段的表達呈現了2次上升和下降的過程, 相鄰兩階段間均有極顯著差異(P＜0.01); 尼羅羅非魚的表達僅呈現一次先上升后下降的過程, 在5—15 dph的表達無顯著性差異(P＞0.05)。團頭魴col2a1b表達水平的2個峰值出現在15和50 dph左右, 尼羅羅非魚col2a1b表達水平的峰值出現在30—40 dph左右,30與40 dph的表達水平無顯著性差異(P＞0.05), 但與25和50 dph有極顯著差異(P＜0.01)。

圖3 col1a1(A)、col1a2(B)和col2a1b(C)在團頭魴和羅非魚不同肌肉組織中的表達Fig.3 Expression of col1a1 (A), col1a2 (B) and col2a1b (C) in the different tissues of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

圖4 col1a1在團頭魴和羅非魚不同發育階段中的表達Fig.4 Expression of col1a1 at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

3 討論

本研究對魚類Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因表達模式與魚類肌間骨發生發育的調控相關性進行了探究。在克隆獲得團頭魴col1a1a、col1a1b、col1a和col2a1b基因CDS序列基礎上, 比較分析了膠原蛋白基因在團頭魴與尼羅羅非魚不同部位肌肉組織和不同發育時期(5—60 dph)尾部肌肉中的表達模式, 為探究Ⅰ、Ⅱ膠原蛋白基因在魚類肌間骨發育過程中的潛在調控作用提供了一定的理論基礎。本研究系統進化分析表明,col1a1、col1a2和col2a1在有刺魚和無刺魚都各自聚為一支, 提示這些基因與魚類肌間骨表型形成潛在相關。研究還表明魚類的col1a1b與col1a1a在進化樹中明顯分為2支, 魚類的col1a1b與人、鼠和雞等高級脊椎動物的col1a1更為靠近, 推測魚類的col1a1在基因復制過程中發生了功能的分化[25], 魚類col1a1b與高等脊椎動物同源性更高。

膠原蛋白能夠引導鈣鹽沉積, 參與骨骼礦化[14],并通過其受體系統促進成骨細胞分化[15]。膠原蛋白基因在團頭魴和尼羅羅非魚不同組織中的表達分析結果顯示, Ⅰ型與Ⅱ型膠原蛋白基因在團頭魴背上肌肉中的表達量高于尾部, 而在羅非魚中尾部肌肉的表達量高于背部。團頭魴Ⅰ型膠原蛋白從背部到尾部肌肉的表達呈逐步下降趨勢, 而肌間骨的生長是從尾端向頭端發育[21], 尾端肌間骨的成熟度較高, 團頭魴Ⅰ型膠原的表達與肌間骨的發育相吻合。與團頭魴相比, 羅非魚沒有髓弓小骨和脈弓小骨[23], Ⅰ型膠原蛋白在尾部上方肌肉中表達量最高, 可能是因為Ⅰ型膠原對肌肉質地的重要影響[26]。相較于尼羅羅非魚,col2a1b在團頭魴背部肌肉組織中的表達量最高, 與團頭魴Ⅰ型膠原的表達模式相似, 推測Ⅱ型膠原與肌間骨的生長發育有一定的相關性[16]。不同生長階段的表達圖譜顯示, 在團頭魴中,col1a1a和col2a1b基因在15和50 dph分別達到高峰, 且以col1a1a的表達變化最為顯著; 在尼羅羅非魚中,col1a1的表達量在30和60 dph分別達到峰值,col2a1b的表達在30 dph達到最高峰。據萬世明等[21]的觀察, 團頭魴的肌間骨在20 dph左右開始萌發, 至40 dph左右基本全部出現。在本研究中團頭魴Ⅰ型膠原蛋白在15 dph(肌間骨出現前)出現第1次表達峰值, 可能是因為骨骼礦化需要大量的膠原補充[13,14];第2次表達峰值(50 dph)出現在肌間骨完全出現后的快速生長期, 這可能是因為Ⅰ型膠原能增強成骨細胞的成骨能力, 并在一定程度上決定骨的韌性和質量[13—15], 所以其表達在肌間骨的成熟和固化過程中再次上調。在本研究中, 團頭魴的col1a1a在不同發育時期的表達量差異巨大, 峰值極高, 與col1a1b的表達水平有明顯差異, 與進化樹分析結果相吻合, 提示col1a1在進化過程中發生了功能的分化[25];col1a1a在15和50 dph表達豐度極高, 提示col1a1與魚類肌間骨發育存在潛在關聯。

圖5 col1a2在團頭魴和羅非魚不同發育階段中的表達Fig.5 Expression of col1a2 at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

圖6 col2a1b在團頭魴和羅非魚不同發育階段中的表達Fig.6 Expression of col2a1b at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

本研究通過肌腱和骨發育相關的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白基因的CDS區克隆和同源性分析, 推測魚類Ⅰ型和Ⅱ型膠原與魚類肌間骨的表型相關。結合尼羅羅非魚和團頭魴不同組織和不同發育時期的基因表達分析, 明確col1a1基因的表達與魚類肌間骨發育有一定的關系, 為肌腱發育形成肌間骨提供了一定的理論支持。