合成微生物群落及在發酵食品中應用研究進展

張小龍，王嘉瑞，李青卓，付彩霞，汪 超，徐 寧*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北武漢 430068；2.湖北土老憨生態農業科技股份有限公司，湖北宜昌 443000）

微生物作為地球上蘊含量巨大且最具發展潛力的生物資源，近年來隨著基因測序技術的發展和成本的降低，人們對微生物的分析在不斷增加。在早期的生物學研究中，研究者的目光主要集中在微生物單群體，其作為微生物群落中的關鍵功能群體將其分離、改造，以實現目標功能的加強[1]。然而人們忽視了微生物并不是單獨存在的，而是處于復雜的、動態的群落中，正是它們的相互作用推動了群落的穩定、功能與進化[2]。近年來，隨著食品發酵技術應用需求的不斷提高，由于功能單一的菌種在提高風味品質方面存在著局限性，使得利用多種功能微生物組合來構建合成微生物群落成了發酵食品領域中一個研究的熱點。所謂的合成微生物群落是指在明確培養基質的條件下，人工將兩種或兩種以上遺傳背景完全解析的微生物通過共同培養而形成的微生物群體，其組成可以是自然界中不一定共存的野生型菌株也可以是一個或多個經基因改造的工程菌株[3-4]。合成微生物群落實現了從傳統單一菌種行為研究向整個微生物群落行為研究的轉變。

合成微生物群落涉及的研究領域眾多，其最終目標是利用單個微生物的個體能力以及微生物間的相互作用，對復雜的代謝任務進行勞動分工、功能互補，從而實現特定的功能，如提高種群的生產力、穩定性、代謝功能等[5]。由于合成微生物群落中的微生物是可控性的，因此可以按功能導向性的需求對微生物進行組裝，使微生物彼此配合發揮更大的作用。而中國傳統的食品釀造是一個典型多菌種參與的復雜過程，因此若能夠構建出穩定高效的發酵微生物群落將對提高發酵食品質量有著重要的意義。該文將對合成微生物群落的特征、微生物間的相互作用和調控機制以及其近年來在發酵食品領域的應用進行概述，并對如何構建穩定、高效的發酵微生物群落進行了展望，旨在為合成微生物群落在發酵食品行業的進一步深入研究及開發應用提供參考。

1 合成微生物群落的特征

與單菌種或自然群落相比，合成微生物群落具有以下特征：①相較于單菌種，微生物群落具有更廣泛的代謝靈活性，通過物種間交流能夠更有效地催化許多復雜過程，執行對單個菌株來說很難甚至是不可能完成的復雜任務[6-7]；②與自然微生物群落相比，合成微生物群落往往更傾向于生態理論的研究，因為合成的微生物群落中的物種是已知的，具有明確的遺傳特性，且復雜性較低、可控性較強[4，8]；③與單菌種相比，群落中微生物物種豐富，可以將復雜的代謝途徑進行劃分，通過成員間的勞動分工和資源交換可以降低細胞的代謝負擔[9-10]；④由于遺傳存在著不穩定性，對于單菌種來說生長環境的改變會對其產生干擾，使其產生不需要的副產物，而微生物群落中混合物種代謝模式多樣，且菌種間存在溝通和交流，使其比單一菌種具有更高的穩定性，對待外界環境的擾動具有更高的抵抗性[11-12]；⑤合成微生物群落與自然微生物群落相比物種較少，且結構簡單，可以從分子系統理論出發，通過網絡推理和元組數據的動態建模進行描述，并且由此可以用來開發和驗證更復雜的、系統的模型[13-14]。

2 合成微生物群落相互作用和調控機制研究

在自然界中，群落的的穩定性通常是通過群落中微生物間的相互作用來調節，因此構建微生物群落必須要考慮微生物間可能存在的相互作用形式，物種間相互作用形式一般分為：通過交叉喂養的方式進行代謝相互作用，通過代謝物和自誘導信號分子的傳遞進行種間相互作用，以及在環境的刺激下進行種間相互作用，因此可以通過改變細胞交流、物種代謝作用、生長環境等方式對微生物間的相互作用進行調控，從而對合成微生物群落進行改造，實現特定的功能。

2.1 微生物間的相互作用研究

自然界中大多數微生物并不是作為一個獨立的個體單獨存在的，而是作為一個復雜的、高度多樣化和高度動態化的微生物群落中的一部分而存在的，在群落中成員之間存在著相互交流和合作，通過成員間的相互作用來影響著群落的行為表現，進而影響著群落的應用[2]。群落中物種間的相互作用機制一直是生態學研究者熱點研究的領域，因為物種間不同類型的相互作用不僅是影響微生物群落結構和功能的主要因素之一，同時也被認為是影響生物多樣性產生的關鍵因素之一[15]。在自然群落中，微生物與其他系統發育類群的微生物不斷相互作用，從而形成復雜的生態相互作用網絡，經研究物種間的相互作用可以分為積極的和消極的兩種類型，積極的相互作用包括共生（互利共生和偏利共生），消極的相互作用包括寄生、捕食以及競爭[16]。由于菌種間存在復雜的交互關系，因此在構建微生物群落時要考慮參與菌種的功能、分布和生長環境等眾多因素，而不是將多種微生物進行的隨機組合。

2.2 基于代謝作用對微生物間相互作用調控

在合成微生物群落中的微生物之間可以通過交換代謝物進行交流，利用資源的共享實現微生物間的相互作用[17]。研究發現在利用蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和泡囊短波單胞菌（Brevundimonas naejangsanensis）混菌發酵生產氫的過程中存在基于代謝物交換介導的相互作用。在發酵過程中蠟樣芽孢桿菌通過代謝作用能夠將淀粉轉化為乳酸，其作為碳源和電子供體，為泡囊短波單胞菌的細胞生長和產氫提供支持；作為回報，泡囊短波單胞菌通過代謝產生甲酸鹽，作為電子載體穿梭到蠟樣芽孢桿菌并供其利用，促進了氫的產生。結果發現混合菌株分別與兩株單菌種發酵相比，淀粉的利用率提高了14.7%和27.5%，氫的產量提高了42.3%和58.2%，從而有效的克服了單一菌株在代謝工程中存在的局限性[18]。此外，群落中的微生物還可以通過交換代謝中間物來影響彼此的活動，這些代謝中間物可以促進或抑制對方的生長，實現物種間的相互作用，進而協調整個群落的活動[19]。

2.3 基于細胞交流對微生物間相互作用調控

在微生物群落中，一些微生物之間存在的細胞交流是基于分泌特定的分子產生的，使得微生物之間存在著許多以不同小分子為依賴的相互作用[20]。目前研究最為普遍的細胞交流方式是基于群感效應的專有信號分子的傳導，這些信號分子包括細胞產生的胞外酶、次級代謝物等，同時微生物還可以利用與新陳代謝和生長有關的化學物質來建立細胞間的相互作用[21]。細菌能夠釋放信號小分子，當信號小分子在周圍介質中積累并達到一定濃度時可以與其他細菌進行交流，通過群落變化來感知鄰近物種的存在，測量它們的細胞密度，調節它們的基因表達，協調它們的團體行為，從而實現了特定的功能[8，22]。研究發現銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）與白色念珠菌（Candida albicans）之間存在著的相互作用是理解真菌和細菌如何通過群體感應系統相互調節的重要模型。通過將銅綠假單胞菌和白色念珠菌共培養時，銅綠假單胞菌可以合成2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮和3-氧-十二烷-高絲氨酸-內酯等小分子，從而構成復雜的群體感應系統，在該系統中，銅綠假單胞菌可以附著在絲狀形式的白色念珠菌上，并合成許多包括苯亞胺、綠膿桿菌、溶血性磷脂酶等小分子，從而有效的抑制白色念珠菌產生有毒物質，減少對人體的傷害[23]。

2.4 基于環境因素對微生物間相互作用調控

在微生物群落中，微生物的生長環境不僅影響著微生物的生長繁殖，同時還影響群落的物種組成，進而影響著微生物間的相互作用。因此在構建微生物群落時可以通過改變物種的生存環境，如改變群落環境中的溫度、濕度、氧氣水平、培養基中營養物質的可利用性以及環境中有毒化合物的存在與否等因素，來協調群落的物種組成，促進物種間的相互作用，從而對合成微生物群落進行改造，實現特定的功能[24-25]。研究發現在利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）混菌發酵面團時可以通過控制氧氣的供應來促進釀酒酵母與舊金山乳桿菌之間的相互作用。在發酵過程中釀酒酵母可以通過代謝作用將糖類轉化為CO2，體系中大量CO2的生成為厭氧型乳酸菌舊金山乳桿菌提供呼吸保護，使其免受氧的抑制，從而有效的促進了舊金山乳桿菌細胞的生長；同時舊金山乳桿菌通過代謝作用可將麥芽糖和蛋白質水解為葡萄糖和氨基酸等物質，以供釀酒酵母利用，混菌相互作用改變了面團發酵體系中微生物的生長環境，促進了二者的生長，使面團的發酵時間對比單菌株縮短，面團中氨基酸含量提高，這對面團品質的提高有著重要的意義[26-27]。

3 合成微生物群落的應用

近年來，隨著科技的不斷發展和對單菌種研究的不斷增加，通過將理論與技術相結合，構建出穩定高效的微生物群落，使得合成微生物群落應用不斷擴展，其中包括發酵食品領域主要涉及醬油、白酒、食醋、酸奶等的生產應用。

3.1 醬油生產應用

微生物在醬油釀造的過程中發揮著關鍵作用，我國醬油生產多采用單一的米曲霉（Aspergillus oryzae）純種制曲，利用米曲霉制曲時分泌的各種酶來分解原料中的蛋白質、淀粉等營養物質并進一步發酵而成[28]。單一米曲霉制曲時對所需原料要求相對簡單，對微生物的生長所需的參數易控制，但其代謝產物的種類和含量不豐富，導致產品的風味物質不足。很多研究者通過構建多菌種的合成微生物群落制曲、發酵醬油，在制曲階段選育多種遺傳背景已知釀造微生物進行混合制曲，通過微生物間的相互交流和互補，來提高醬油產品風味和生物活性成分[29-30]。如PENG M Y等[31]研究發現，通過將米曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger）混合制曲能夠提高蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活力，增加了原料中蛋白質和淀粉的水解效果，同時在總酚含量、總黃酮含量、三種異黃酮苷元（大豆苷元、糖苷元、染料木素）和抗氧化活性方面，混菌發酵均高于純種制曲發酵，這對提高醬油的產量和質量具有重要作用。

3.2 白酒生產應用

傳統白酒的釀造屬于典型的自然發酵，發酵體系中存在著以酵母為主的復雜微生物結構，然后通過這些微生物的生物轉化完成了白酒的釀造。根據酵母在釀酒中的作用，可將酵母分為釀酒酵母和非釀酒酵母兩大類。釀酒酵母具有較高的發酵速率和發酵能力，在白酒釀造中主要完成酒精的發酵，同時通過代謝作用能夠產生高級醇類、酯類、有機酸等多種揮發性物質[32]。相對于釀酒酵母，非釀酒酵母雖然發酵能力較低，但具有較強的產酶能力，能夠將原料中的前體物質經過一系列生化反應形成酸、酯、醛和高級醇等揮發性風味物質，同時這些菌在白酒發酵過程中還能有效抑制一些腐敗菌的繁殖，這對提高白酒的品質有著重要作用[33-34]。隨著白酒市場的不斷擴大，人們對白酒品質的要求也更加嚴格，所以由傳統的單一菌種釀造向混菌釀造方面成為了研究熱點，有研究發現與酵母單獨釀造相比，酵母混菌發酵出的白酒風味物質更加豐富[35-36]。如ZHA M S等[37]利用釀酒酵母和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混菌發酵釀造白酒，結果發現混菌發酵提高了酵母的細胞代謝活性，促進了發酵液中乙醇和乙酸乙酯的生成，從而有效改善了發酵液的風味特性，提高了白酒的品質。

3.3 食醋生產應用

食醋在釀造過程中由于原料和曲中微生物的自發富集形成了復雜的菌群結構，不同地區由于食醋群落結構的差異造成了食醋風味的差異。隨著對食醋中微生物群落研究的深入，利用合成功能菌群來增強食醋中的風味特征和功能物質已獲得突破[38]。乙偶姻是食醋的一種重要風味物質，也是食醋中活性成分川芎嗪的前體之一，其含量對食醋品質有著重要的影響[39]。為了提高食醋中乙偶姻的含量，可以通過向食醋中直接添加食品級的乙偶姻或者利用內源性微生物強化兩種方法。而目前市面上銷售的食品級乙偶姻多是通過化學方法合成不僅價格昂貴，而且直接添加也可能會因為化學物質的引入而影響食醋的安全性，因此采用內源性微生物強化的方法來提高乙偶姻的產量成為了研究熱點，相較于前一種方法，這種方法不僅降低了乙偶姻的生產成本，而且更加健康安全[40-41]。已有研究揭示了巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianum）和5種乳酸菌（（短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、布氏乳桿菌（Lactobacillus brucei）和發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum））是合成乙偶姻相關的功能菌[42-43]。邱婷[44]以這6株功能菌株為研究對象，分別利用這幾種乳酸菌和醋桿菌進行混菌發酵合成乙偶姻，結果發現與單菌種發酵相比干酪乳桿菌和巴氏醋桿菌構成混菌體系可顯著提高乙偶姻含量，同時促進了酯類物質的積累，這為傳統食醋中乙偶姻的強化生產指明方向，對提高食醋的品質有著重要的意義。

3.4 酸奶生產應用

由于傳統的酸奶發酵過程開放程度高，容易滋生和感染各種雜菌，導致其發酵產物不穩定，影響了酸奶的品質。因此有研究者提出通過從優質酸奶中分離出其中的功能菌群并加以利用，來提高酸奶的品質[45-46]。酸奶中的風味物質主要來源于微生物對原料中乳糖、蛋白質的分解代謝，已有研究發現與單一的發酵劑相比，利用混菌作為發酵劑可有效改善酸奶的風味特性，提高酸奶的品質[47]。目前商業生產酸奶一般采用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌作為發酵劑，通過兩種菌的協同作用加快了酸奶的酸化速率，提高了酸奶中芳香化合物的含量，增強了酸奶的營養價值[48]。隨著對酸奶中益生菌研究的不斷深入，發現胃酸和膽汁對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌具有較強的殺傷作用，使其無法在腸道內定植，從而使其有益作用受到了極大限制[49]。研究者通過模擬胃腸道實驗發現嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）具有較強的胃酸和膽汁鹽耐受性，可在腸道內大量存活，且嗜酸乳桿菌還具有較強產酸能力，適用于酸奶的發酵[50-51]。如李子葉等[52-53]以牛奶作為發酵基質，利用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌發酵酸奶，結果發現與未加嗜酸乳桿菌的發酵組相比其產酸速率更快，酸奶中的活菌數更多，乙醛等風味物質含量更高，同時嗜酸乳桿菌還具有降低膽固醇含量、增強人體免疫力的作用，這對酸奶的益生功能的進一步增強有著重要的意義。

4 總結和展望

合成的微生物群落不僅可控性高、穩定性好，而且還能夠通過微生物之間的相互作用執行單一菌株難以完成的復雜任務，使其成了發酵食品領域研究的熱點。中國傳統的發酵食品屬于典型的自然發酵，發酵過程中由于開放程度較高，使得發酵體系中微生物構成復雜，因此發酵完成不僅僅取決于單個微生物作用的疊加，還依賴著微生物間復雜的交互作用?，F階段對食品發酵微生物種群的作用關系和代謝網絡的研究較少，想要調控微生物群落的發酵功能必須了解參與各種發酵生化反應的微生物，通過代謝網絡模塊化處理將發酵任務分解，確定關鍵微生物的單元任務，并通過調節發酵參數和強化菌株功能來實現調節微生物群落的代謝功能的目標。今后隨著對于食品微生物群落的組成、功能和相互作用的深入研究，借助合成微生物群落的理論和研究方法，設計和構建出穩定高效的靶向精準的合成食品發酵微生物群落，將對我國發酵食品發展進步有著重要意義。