牙髓組織工程支架材料研究進展

張林樸 鄒慧儒

天津市口腔功能重建重點實驗室，天津市口腔醫院暨南開大學附屬口腔醫院中心實驗室 300041

0 引 言

波及牙髓的牙外傷、齲病等牙體硬組織疾病常引起不可逆的牙髓壞死及根尖周病變，導致牙體組織失去營養供給，使牙髓組織喪失應激防御功能，進而導致牙齒遭受更大的破壞。牙髓再生治療可恢復牙髓活力，促進未發育完成的年輕恒牙牙根繼續發育，有助于避免牙齒折裂或其它并發癥的發生。全球有超過2/3的人罹患齲病、牙髓病[1]。在牙體牙髓病臨床診療中，牙髓再生需求廣泛。

目前，由于臨床上還沒有確定有效的全牙髓再生治療方法，以牙髓細胞、支架材料、生長因子構建活體牙髓的組織工程牙髓再生一直是國內外研究的熱點。Xuan等[2]報道了至今世界上病例數最大的使用脫落乳牙牙髓干細胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED)移植獲得年輕恒牙牙髓再生和牙根持續發育的臨床研究。由于牙本質壁包繞牙髓形成的髓腔及根管系統狹小、多變，且牙髓組織內含神經、血管等結構，組織工程牙髓再生需要綜合考慮血運重建、神經再生、生長因子參與和牙髓-牙本質復合體的形成，因而對支架材料選擇具有特殊要求。除常規生物相容性、適當的力學特性和生物降解性、連通孔隙度、促細胞黏附、增殖和分化能力，以及誘導因子的結合外，尚需介導牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）與牙本質壁結合再生牙本質，實現牙髓-牙本質復合體再生[3-6]。選擇接近牙髓微環境構成的材料，如天然或天然衍生聚合物材料多糖、蛋白質多肽，合成聚合物材料聚酯類多聚體以及功能互補材料結合的復合物，特別是適合牙髓多變形態的可注射水凝膠復合物成為目前研究關注的熱點[7]。本文將對牙髓再生研究中組織工程支架材料的應用作簡要概述。

1 天然和天然衍生聚合物支架材料

1.1 多糖類支架材料

多糖是以糖苷鍵鏈接單糖單位的長鏈碳水化合物多聚體。天然多糖藻酸鹽、殼聚糖、透明質酸支架材料常用于牙髓再生研究。

1.1.1 海藻酸鈉

海藻酸鈉（sodium alginate,Alg）是一種海藻類來源的多聚糖醛酸鹽，水溶液遇二價陽離子，如Ca2+，發生離子交聯形成水凝膠。其凝膠的固化條件溫和，能減小蛋白質變性，延長其活性周期，具有良好的生物相容性和流變可注射性。分子交聯網絡結構有利于細胞生長，可形成支持細胞間大分子物質擴散及細胞間信號傳導的三維立體微環境。Fujiwara等[8]將兔牙髓細胞與海藻酸鈉支架結合移植到裸鼠背部皮下，6周后移植部位可觀察到X線阻射鈣化結構，并檢測到Ⅰ型和Ⅲ型膠原和牙本質涎蛋白表達，發現有成牙本質樣細胞和牙本質樣硬組織形成，說明海藻酸鈉可以作為牙髓-牙本質復合體再生的支架材料。

1.1.2 殼聚糖

殼聚糖（Chitosan）是天然多糖甲殼素脫除部分乙?；漠a物，其結構與細胞外基質中的糖胺聚糖相似。殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌活性和成骨誘導活性，有利于細胞黏附，同時還可結合生長因子、葡糖氨基聚糖等；但其水溶性差，在pH低于5.5時可溶，當pH大于6或在二價、多價陰離子作用下形成水凝膠。殼聚糖水凝膠強度較低且降解較快。單一組分的殼聚糖攜帶大量正電荷，對細胞的吸附力過強，不利于細胞增殖，需與聚陰離子材料交聯中和部分電荷，以改善材料表面性能。Zheng等[9]研究證實結合堿性成纖維細胞生長因子的三維多孔殼聚糖支架可有效促進人牙髓干細胞黏附和遷移，保持細胞增殖活性，并有利于向神經細胞方向分化，體現了較好的促細胞分化特性。Shrestha等[10]將包被或吸附地塞米松的殼聚糖納米顆粒貼附于經次氯酸鈉處理的牙本質表面，結果顯示其有助于保持細胞在牙本質表面的黏附活性，消除消毒劑對細胞活性的影響，有望用于牙髓-牙本質復合體再生研究。

1.1.3 透明質酸

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸為雙糖單位重復串聯而成的直鏈酸性黏多糖。透明質酸廣泛存在于皮膚、眼睛、關節等組織中，具有滋養和潤滑組織、促進細胞附著等作用。有研究顯示HA支架具有良好的促進組織再生能力，可直接作用于牙源性干細胞表面受體，激活相關信號通路，促進細胞遷移[11]。Inuyama等[12]在HA海綿中接種成牙本質細胞，結果顯示成牙本質細胞可黏附于支架材料，形成穩定結構。Chrepa等[13]發現HA水凝膠包被牙根尖乳頭干細胞（stem cells of the apical papilla,SCAP）后可顯著促進成牙本質細胞分化和礦化沉積，提示該支架材料具有潛在應用前景。

1.2 蛋白質多肽

1.2.1 膠原蛋白與明膠

膠原蛋白（Collagen,COL）是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白，在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中含量最豐富，具有連接和支撐細胞和組織結構的作用。膠原蛋白中I型膠原（COL I）含量最為豐富，約占90%，是組織工程中使用最頻繁的支架材料之一。對比其它類型膠原蛋白，COL I可以更好地促進牙髓細胞增殖與礦化[14]。Sumita等[15]制備膠原三維支架材料，結合人牙髓干細胞（human DPSCs，hDPSCs）和釉基質蛋白，觀察到有器官化分化的牙髓組織生成，提示該支架材料性能優異。

明膠是一種由動物組織提取的膠原蛋白水解的蛋白質。其化學組成非常接近膠原，具有與膠原相近的生物相容性、可降解性和低抗原性等特點，且價格低廉。明膠通常用作細胞培養的生物襯底和載藥工具。組織工程應用需通過結合多肽、礦化顆粒、金屬離子等附加修飾以及結構改性達到調節細胞黏附和誘導組織功能分化作用。Qu等[16]使用納米纖維明膠添加磷酸鎂仿生構建接近牙本質基質的納米結構水凝膠支架材料，可促進牙髓細胞增殖、分化和礦化沉積，體外復合培養和裸鼠體內植入實驗均顯示成牙本質分化相關標記物有顯著表達，且出現礦化物沉積。

1.2.2 纖維蛋白

纖維蛋白是血漿纖維蛋白原經凝血酶激活后聚合形成的產物。對比合成的聚合物和膠原凝膠，纖維蛋白在生物相容性、免疫原性、價格等方面具有很大優勢。自體來源的纖維蛋白可從血漿離心直接獲取，不引起任何免疫反應且可形成各種形態的三維結構。通過結合聚氨基甲酸乙酯、聚乙烯、透明質酸或磷酸鈣陶瓷等，纖維蛋白支架的結構性能已獲得顯著改善[17]。

1.2.3 絲素蛋白

從蠶絲獲得的絲素蛋白是一種能形成纖維的天然蛋白質，被用于醫用縫線已近一個世紀。絲素蛋白的蛋白質纖維由絲心蛋白和絲膠蛋白組成。富含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等多種氨基酸，具有強度高、彈性好、機械性能穩定和降解率低等特點[18]。絲素蛋白能夠通過碳二亞胺偶合成含RGD片段的多肽，通過結合生長和黏附因子增強細胞黏附和增殖能力[19]。Pecci-Lloret等[20]將hDPSCs直接接種在三維多孔絲素蛋白支架上，掃描電鏡觀察可見24 h內細胞在支架表面黏附伸展，之后逐漸生長至完全覆蓋多孔支架表面，提示該支架材料能夠支持細胞黏附和增殖。

1.2.4 多肽與自組裝多肽

多肽是氨基酸以肽鍵連接形成的短片段，其組成氨基酸分子中的各基團組裝形成特定空間結構，因而具有特殊的生物學活性。多肽水凝膠可模擬細胞外基質，為細胞生長提供理想的生活環境，在組織工程應用中也更具可操作性。多肽分子通過自組裝，形成功能性多肽，通過與細胞表面分子序列黏附、作用于酶解位點或與生長因子受體結合誘導細胞響應。Galler等[21]報道自組裝含RGD序列的親水性多肽（GTAGLIGQERGDS），并將氨基端乙?；?，其水溶液與含CaCl2的人牙髓細胞或脫落乳牙牙髓干細胞懸液混合形成多肽水凝膠，可顯著促進細胞增殖，并誘導鈣化沉積形成。

2 人工合成聚合物材料

合成聚酯類多聚體如聚乳酸（Polylactide,PLA）、聚乙醇酸（Polyglycolic acid,PGA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactide-co-glycolide acid,PLGA）、聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）、聚乙酸內酯（polycaprolactone，PCL），具有良好的生物相容性、生物降解性且價格低廉；另外，其力學性能、黏稠度、顆粒度或多孔纖維網形態、生物大分子的結合與釋放性能等可進行特定設置，對細胞黏附和組織分化誘導具有明確作用[22-24]。Gangolli等[25]分別使用質量濃度為12%和20%的PLGA（75:25）構建整體厚度為（277±15）μm復合雙層膜支架材料，孔徑分別為（30～45）μm和（5～10）μm，接種hDPSCs后發現細胞可在大孔徑膜內黏附伸展至接近支架全層，而小孔徑膜組細胞只能黏附在膜表面或僅伸展至支架表層。

截至目前，有多項以PLA或PLGA為支架材料承載牙源性干細胞的動物實驗研究證實該策略可獲得牙髓組織再生。其中有El-Backly[26]等使用兔源牙髓細胞；Cordeiro等[27]和Sakai等[28]使用人SHEDs；Huang等[29]使用人SCAPs接種到PLA或PLGA多孔纖維網絡支架中，然后分別植入到實驗兔或裸鼠體內，實驗結果均發現可形成與生理性牙髓組織細胞成分和結構非常接近的組織，在髓腔及牙本質表面有類似于管狀雙層結構的礦化牙本質形成。

3 復合支架材料

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是存在于哺乳動物體內的包繞細胞的復雜實體結構。主要包括結構蛋白（膠原和彈力蛋白）、特殊蛋白（原纖蛋白、纖連蛋白和層黏連蛋白）、葡糖氨基聚糖類（透明質酸）等。ECM不僅可提供結構支撐，還提供細胞代謝環境，細胞通過該介質以完成代謝和信息傳遞。因此，任何單一組分的組織工程支架材料均無法代替ECM的作用，均需不同組分進行組合，以實現功能互補；或需要活性基團修飾或生長因子參與，才能更好地發揮支架材料作用。在牙髓組織工程應用中，將ECM成分通過親水性介質或親水基團與水分子構成水凝膠，更便于多變狹窄形態髓腔內的操作使用[30]。

3.1 多糖類復合材料

HA具有良好的細胞滋養作用。Lee等[17]報道一種由HA酪胺（HA-Tyr）和纖維蛋白組成的互穿網絡水凝膠，能顯著促進細胞增殖和毛細血管形成。但HA力學性能差、體內降解快，因而需結合性能互補材料進行修飾。Jones等[31]以聚乙二醇二醋酸鹽（polye thylene glycol diacrylate，PEGD A）為介質，將HA與膠原交聯，構成可注射水凝膠支架，具有良好的臨床可操作性，可顯著增強hDPSCs細胞的增殖、遷移、分化活性。黃健萍等[32]研究鈣黏蛋白多肽修飾的HA水凝膠，將其結合hDPSCs，體外實驗發現牙髓細胞可以向神經細胞分化誘導，裸鼠體內實驗觀察到有鈣化沉積形成。曹春玲等[33]使用羥乙基殼聚糖，借助苯甲醛修飾的聚乙二醇（OHC-PEO-CH O）共價交聯，形成水凝膠，可顯著提高牙髓細胞增殖活性。進一步實驗將海藻酸鈉和氯化鈣溶液混入前二者組分中，可形成羥乙基殼聚糖和海藻酸鈉雙網絡水凝膠，從而顯著提高凝膠網絡的抗壓縮力學性能和成牙本質分化性能。

3.2 蛋白質多肽類復合材料

3.2.1 膠原、明膠基質復合材料

由于膠原是細胞外基質的主要結構蛋白，有膠原蛋白（COL）包被或修飾的特異性功能增強型材料可使其獲得更接近細胞外基質的屬性，并克服自身機械性能差、易吸收等缺點。Nosrat等[34]使用含有牛COL I和羥基磷灰石顆粒的膏體作為根管內支架材料，用于未成熟前磨牙治療，結合根尖誘導出血形成根管內血凝塊。組織學實驗結果證實，COL I支架結合來自于根尖的干細胞，在根管壁表面形成新生牙本質，并出現礦化；而單純誘導根管內血凝塊的根管壁僅有新生纖維結締組織和不定型礦化物形成。Zou等[35]制備一種經COL I表面修飾的PLGA纖維網絡支架，接種hDPSCs，發現其可顯著促進細胞增殖與成牙本質細胞分化以及牙本質鈣化沉積，形成緊密結合的三維復合體。研究證實COL I表面修飾增強了細胞在PLGA纖維網絡支架表面的黏附伸展。Kim等[36]將微孔生物活性玻璃納米顆粒結合在聚乙酸內酯明膠納米纖維基質中，發現其能通過整合素、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路促進hDPSCs的成牙本質分化。Nakashima等[37]使用粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）動員的自體牙髓干細胞，將其加入含有G-CSF的去端肽膠原溶液中，植入根管預備后的根管內，膠原海綿封閉髓腔后，玻璃離子水門汀墊底，復合樹脂充填。通過5例臨床探索性研究確定再生的牙髓組織具有活力，并觀察到功能性牙本質形成。

3.2.2 絲素蛋白復合材料

絲素蛋白的特性有利于體外制備形成三維纖維網絡結構，在此基礎上，添加特異性誘導分化材料或生長因子，可促進細胞完成功能分化。Zhang等[38]在六氟二丙醇基（hexafluoro-2-propanol,HFIP）絲素蛋白和水合絲素蛋白多孔支架上接種新生4 d大鼠牙囊細胞，發現這些絲素支架不僅可誘導骨性牙本質形成，還對骨性牙本質形態與大小具有調控作用。接種hDPSCs也觀察到鈣化結節的形成以及牙髓組織形成。此后，該課題組制備絲素蛋白/羥基磷灰石支架結合hDPSCs放置在牙根管中植入裸鼠皮下，通過在該支架材料中混合超順磁性氧化鐵微粒，MRI成像觀察發現支架材料性能穩定，細胞毒性小，組織再生與材料降解相適應。免疫組化分析顯示有成牙本質分化相關蛋白陽性表達，HE和茜素紅染色顯示根管內有再血管化和礦化組織形成[39]。Yang等[40]在結合有堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）的絲素蛋白多孔支架中接種hDPSCs，放置在牙根段的髓腔中，然后異位植入裸鼠體內，4周后取出，結果發現結合bFGF的支架材料hDPSCs復合體形成具有良好脈管結構的牙髓樣組織，并且有新基質沉積和牙本質樣組織形成。說明添加特殊生長因子的絲素蛋白支架材料能夠支持hDPSCs的功能性分化。上述研究均提示絲素蛋白作為一種性能優良的支架材料，在牙髓再生應用研究中將發揮重要作用。

3.2.3 多肽類復合材料

多肽容易合成，且比較穩定，多種氨基酸片段有寬泛的組裝剪切選擇，可以形成納米纖維結構，因此越來越多地應用于牙髓再生研究中。Chan等[41]將hDPSCs包裹于自組裝多肽納米纖維水凝膠中，細胞凝膠復合體經體外礦化誘導培養后，植入裸鼠皮下，4周后取出?？梢娾}化組織和毛細血管形成，且檢測到多種成骨標記物陽性表達，X線阻射影達到78%。體現了自組裝多肽納米纖維支架支持hDPSCs特異性分化的作用。Galler等[42]以具有細胞黏附性的自組裝多肽納米纖維水凝膠包裹hDPSCs，添加成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF）、轉移生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）以及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）。結合細胞和生長因子的水凝膠復合物放置在牙根段髓腔內，植入裸鼠皮下，形成血管化類牙髓組織。Xia等[43]制備含RGD片段和模擬VEGF肽段表位的自組裝多肽水凝膠，接種DPSCs和臍靜脈內皮細胞，觀察到該支架材料可以促進細胞增殖、誘導微血管形成，有望用于牙髓-牙本質復合體再生。

工程化設計的功能基團及可注射水凝膠系統使多肽支架具有商品化應用優勢。Dissanayaka等[44]使用PuraMatrix多肽水凝膠，評價其在體內形成血管化牙髓再生的潛力。他們將人臍靜脈內皮細胞和hDPSCs包裹在PuraMatrix多肽水凝膠中，在沒有外源性生長因子作用下，多肽納米纖維微環境支持細胞增殖、遷移和毛細血管網形成。將單純hDPSCs或復合細胞水凝膠植入實驗大鼠體內，均觀察到有鈣化牙本質斑塊的牙髓樣組織形成。復合細胞水凝膠組顯示有更多細胞外基質、血管和鈣化組織形成。此外，一種商業化應用的多肽鏈——Dentonin，其含有整聯蛋白結合域（RGD）和磷酸糖蛋白糖胺聚糖結合域（SGDG），而細胞外基質磷酸糖蛋白（m atrix extracellular phosphoglycoprotein，MEP E）是激活DPSCs增殖和成牙本質分化的關鍵起始活性基團。因此Nguyen等[45]利用Dentonin結合一種水溶性自組裝多肽根鏈，改性形成可注射納米纖維多肽水凝膠，混合細胞后體外培養。結果顯示，對比單純多肽根鏈組和以類似Dentonin肽鏈替代修飾組，功能性多肽水凝膠對混合的成纖維細胞或DPSCs具有顯著促進增殖作用，并能形成正常牙本質鈣化沉積。

3.3 生物基質提取物復合材料

生物基質提取物是從動物或人體血漿或特定組織中提取的含部分細胞或無細胞成分，含有組織基質多種組成成分和特定組織細胞功能分化信息，可直接作為支架材料用于組織工程。

3.3.1 富血小板濃縮物

富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）是一種來源于血漿成分通過特定離心方式得到的含高濃度血小板的血漿提取物，自20世紀90年代中期開始用于口腔醫學領域，可顯著促進創口愈合。通過改進離心方法，目前已發展形成第2代血漿制品的富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）和第3代的濃縮生長因子（concentrated growth factor,CGF）。PRP、PRF、CGF作為血漿提取物研究的3個階段的產物，在血小板濃縮量、白細胞含量、纖維蛋白凝塊形成和結構特征等方面有明顯不同，因而有著不同的臨床應用價值。

PRP、PRF、CGF和其相關的組成成分（生長因子和纖維蛋白）可顯著促進牙源性干細胞增殖、遷移與功能分化，對牙本質再生和血管新生具有明顯促進作用[46-48]。有研究顯示PRF的作用優于PRP，并能在炎癥微環境中保持對DPSCs的促增殖、遷移與分化作用[47]。研究還顯示DPSCs可緊密結合在富含血小板和白細胞的密集纖維蛋白網絡的CGF支架表面，細胞突觸伸展到CGF的微孔中，細胞之間借偽足突觸形成緊密連接，形成良好三維空間結構[48]。因而血小板濃縮物具有支架以及釋放生長因子的雙重作用，可用于牙髓再生研究。

由于來源于自身的血漿成分獲取方便，無免疫原性，含有天然生長因子和纖維蛋白網架結構，已有研究將其作為無細胞支架，結合刺激根尖周出血直接應用于臨床牙髓再生治療。由于研究背景的差異，有個別研究認為結合使用PRP、PRF、CGF和目前臨床單純使用刺激根尖周出血引流到根管內的血凝塊充盈法治療效果無顯著差異[49]，但是多數研究報告認為結合PRP、PRF或CGF的治療方法可趨化誘導根尖組織來源干細胞，獲得根管壁增厚、牙根延長、根尖孔縮窄的效果，而且根尖孔閉合程度、牙根增長長度、牙髓感覺功能恢復程度和根管壁新生牙本質沉積量等中、遠期效果尤其顯著，優于目前臨床常規采用的血凝塊充盈法[50-52]。其內在機制尚有待進一步研究。

3.3.2 牙本質基質提取物

Athirasala等[53]研究認為包繞牙髓腔的牙本質基質中含有大量促牙髓生成信號分子。其中有機基質可以分為兩種主要組分：①不溶于酸性條件并在組織中占比最高的有機成分I型膠原。②小分子非膠原蛋白，如附加糖胺聚糖（Glycosarninoglycans,GAGs）的蛋白聚糖（Proteoglycans,PGs）和生長因子。而牙本質基質蛋白保有對細胞存活、增殖和分化有重要作用的正常細胞黏附位點（RGD）和基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein,MMP）結合位點。利用海藻酸鈉具有的強成膠能力，將二者以不同比例組合，制備海藻酸鈉-牙本質基質（Al g-Dent）復合溶液；然后接種人SCAPs或hDPSCs，構成3D打印母液，打印時以CaCl2共價交聯形成凝膠。結果顯示適當比例的Alg-Dent在體外復合細胞，能持續保持細胞活性。這無疑是一種保持高度牙髓細胞增殖與分化活力和更具可操作性的支架材料的選擇。

4 結 語

綜上所述，組織工程牙髓再生支架材料相關體外實驗研究已在細胞增殖、分化以及與支架結合機制方面取得較大進展，體內動物實驗已獲得接近正常牙髓組織各組分和成牙本質細胞貼附根管壁、具有牙本質小管形態的新生牙本質沉積等牙髓-牙本質復合體再生證據，同時也有為數不多的獲得成功的牙髓再生臨床研究報告。然而，牙髓-牙本質復合體結構復雜，組織工程再生策略臨床應用還受到相當多的條件限制，有待進一步深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突