芝麻素對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的影響及PKCα/NF-κB信號途徑的作用研究

周鵑，馮晶，汪偉，余超，張帆，秦偉偉

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┙陙淼陌l病率逐漸升高，且呈現年輕化傾向[1]。研究指出，心肌缺血導致心臟供氧減少是其直接表現，無法有效支持心臟正常工作，部分患者甚至出現心肌細胞凋亡[2]。脂代謝異常、血管內皮功能損傷可能導致冠心病的發生以及嚴重心腦血管事件發生，甚至引起死亡[3]。激活蛋白激酶C（PKC）被激活后可有效刺激核轉錄因子κB和絲裂原活化蛋白激酶水平異常升高，導致TNF-α、組胺、IL-6等炎癥介質的大量釋放，加重冠心病的進展[4]。芝麻素是芝麻的重要組成成分，具有改善血管肥厚、心肌，降低膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），抗氧化，減少中風發生等[5]。此外動物研究結果顯示，單純高脂飲食可導致大鼠出現動脈粥樣硬化，使用芝麻素干預后則可有效改善大鼠動脈粥樣硬化程度[6]。但芝麻素對冠心病療效和作用機制尚無相關報道，筆者擬構建冠心病大鼠模型，分析芝麻素對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的影響及PKCα/NF-κB信號途徑的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組本研究選用30只SPF級雄性SD大鼠，體重140～180 g，購買自南京青龍山實驗動物繁育場，分籠飼養，SPF動物房適應性飼養1周，自由飲食飲水和采光。將大鼠分為對照組、模型組和觀察組3組，每組各10只。

1.2 分組處理方法模型組和觀察組大鼠進食高脂飼料（69%基礎飼料、20%豬油、5%白糖、3%膽固醇、2%蛋黃粉、1%維生素D、0.2%丙基硫氧嘧啶）連續飼養16周，自由飲水。16周后，禁食，采用3 ml/kg 25%烏拉坦麻醉腹腔注射、30 μ/kg垂體后葉素。記錄心電圖，評估心肌缺血程度時以J及T波改變作為標準。對照組大鼠予以基礎飼料喂養。觀察組造模完成后芝麻素（80 mg/kg）灌胃治療1/d，對照組和模型組大鼠應用等體積生理鹽水進行干預，持續灌胃6周。

1.3 觀察指標干預結束后禁食12 h，鼠尾采血法取血，后3000 rpm/min離心10 min，收集血清檢測三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。麻醉后取大鼠胸主動脈，剪除結締組織，剪3～4 mm血管環，懸掛K-H液氣管浴管，連接張力換能器，給予95%氧氣和5%二氧化碳混合，血管環穩定后使用去氧腎上腺素（1μM）干預。張力恢復1 g后，使用1 μM去氧腎上腺素收縮血管，達峰值10 min后，給予乙酰膽堿，穩定后并平衡至基礎張力。收縮達峰值后給予以酸化亞硝酸鈉，以1 μM去氧腎上腺素，記錄血管張力變化。大鼠心肌組織切片后，使用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡情況，鏡下記錄凋亡細胞數，計算心肌細胞凋亡率。稱量大鼠心肌組織重量，冰上操作使用裂解液制備組織勻漿，用Western-blot法檢測組織中Caspase-3、Caspase-12、PKCα、p-PKCα、p-IκBα、IκBα、NF-κB、NF-κB p65和β-actin水平。

1.4 統計學方法使用ImageJ軟件分析Western blot法檢測結果，采用SPSS 20.0統計軟件包進行統計學分析，采用mean±sd表示計量資料，方差檢驗分析多組計量資料差異，以P＜0.05，為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠脂代謝水平檢測結果本組研究結果顯示，各組大鼠TG和HDL-C水平無明顯差異（P＞0.05），三組的TC水平存均在明顯差異，且差異具有統計學意義（P＜0.05），觀察組大鼠TC水平明顯低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05），表1。

2.2 大鼠血管內皮功能檢測結果研究結果顯示，各組大鼠血管內皮經酸化亞硝酸鈉處理后血管最大舒張程度無明顯差異（P＞0.05），但經ACH處理后，三組大鼠血管最大舒張程度間存在明顯差異，且差異具有統計學意義（P＜0.05），觀察組大鼠ACH處理血管最大舒張程度明顯低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05），表2。

2.3 大鼠心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白調查結果結果顯示，各組大鼠心肌細胞凋亡率、Caspase-3和Caspase-12存在明顯差異，差異具有統計學意義（P＜0.05），觀察組大鼠心肌細胞凋亡率明顯低于模型組，Caspase-3和Caspase-12蛋白表達水平明顯低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05），表3。

表1 大鼠脂代謝檢測結果（mmol/L）

表2 大鼠血管內皮功能檢測結果

表3 大鼠心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白調查結果

圖1 凋亡相關蛋白檢測圖

2.4 大鼠心肌細胞PKCα/NF-κB信號蛋白檢測結果結果顯示，各組大鼠心肌細胞p-PKCα、p-IκBα和NF-κB p65間存在明顯差異，差異具有統計學意義（P＜0.05），其中觀察組大鼠心肌細胞p-PKCα、p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達水平明顯低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05），表4。

表4 大鼠心肌細胞PKCα/NF-κB信號蛋白檢測結果

圖2 PKCα/NF-κB信號蛋白檢測結果

3 討論

研究指出，冠心病多伴血脂異常，是異常動脈粥樣硬化的獨立性因素[7]。有學者指出，黏附內皮細胞、單核細胞數量明顯增加，細胞移入內膜下，有效吞噬低密度脂蛋白，導致硬化病變[8]，隨著TC水平長期處于增高狀態，導致冠心病事件發病率逐年增高。高脂高糖飲食可制備冠心病模型，且與病理特征相似[9]，使血壓升高和血管內皮功能障礙。研究指出，單純高糖飲食可提升體內活性氧水平，抑制一氧化氮合酶活性，導致血管舒張功能障礙[10]。長期高脂高糖飲食易伴隨血管內皮功能障礙，改善血管內皮功能有助于冠心病的防治[11]。

模型組飼養6周后大鼠血脂水平顯著升高，可見冠心病改變。采用芝麻素干預6周后，大鼠TC水平顯著改善。分析認為，芝麻素可抑制腸管中膽固醇的吸收，加速膽固醇溶解性下降，加速降低血脂水平，阻礙膽固醇合成，抑制體內膽固醇合成相關酶活性，但改善TG和HDL-C水平療效一般，可能與觀察時間短有關。冠心病的病理過程中多伴隨出現不同程度的血管內皮功能損傷，并出現血管內皮舒縮功能失調。本研究使用ACH干預大鼠胸主動脈可誘導血管舒張效應，冠心病模型可出現血管內皮依賴性舒張障礙。結果顯示，冠心病大鼠采用芝麻素干預治療后，可緩解主動脈對ACH舒張反應，激活體內一氧化氮生物活性。

研究顯示，PKC激活后可激活IκB激酶復合物，通過泛素-蛋白酶體途徑降解，NF-κB與IκB形成復合物并釋放進入細胞核，與DNA上特異性序列結合，引起IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8基因的轉錄[12,13]。PKC信號介導NF-κB激活在冠心病的發生發展過程中發揮著重要作用[14]。PKC/NF-κB途徑活性增高可提高炎癥細胞因子表達水平升高，通過siRNA干擾PKCα后顯著降低炎癥因子表達[15]。此外，PKCα磷酸化IκBα后進一步激活NF-κB介導氣道變態反應性疾病。本組研究結果顯示，冠心病大鼠模型心肌細胞的PKCα、IκBα及NF-κB磷酸化程度加重，應用芝麻素干預后可有效抑制PKCα、IκBα及NF-κB磷酸化，抑制PKC/NF-κB途徑活性。分析認為，芝麻素可有效抑制冠心病大鼠心肌細胞的異?；罨?，抑制PKCα/NF-κB信號轉導途徑并降低體內多種炎癥介質釋放。

綜上所述，芝麻素通過調控PKCα/NF-κB信號途徑有效抑制冠心病大鼠心肌細胞凋亡。但本研究并未對大鼠體內基因水平差異進行分析，有待后續持續追蹤報道。