小動物精準放療系統在小鼠腫瘤放療模型中的應用

吳安慶，聶 晶

（蘇州大學 放射醫學與防護學院，江蘇 蘇州 215123）

惡性腫瘤是威脅人類健康的高死亡率疾病之一。人類對于惡性腫瘤還沒有某種特別有效的治療方法，常用的治療手段為放射治療、手術治療和化學治療，約有50%～70%的腫瘤患者需要不同程度地接受放射治療[1]。隨著醫療影像技術、計算機圖像處理技術迅速發展，放射治療設備不斷升級，放射治療進入了“精準放療”的時代，定位精度越來越高，劑量聚集性越來越好，能夠將放射線全部集中在腫瘤部位進行大劑量照射，并且避免腫瘤周圍正常組織接受照射，有效地減少放療的副作用[2]。因此，針對臨床前基礎研究的小動物精準放療設備也應運而生，主要用于放射生物學效應機理、輻射防護藥物、多模態治療等研究的動物水平實驗。

1 小動物精準放療系統簡介

小動物精準放療系統是一種圖像引導的可視化放射治療系統（small animal image-guided radiation therapy system）是為了解決臨床放療的疑難點和找到新的放療方法或途徑而生產的一款用于臨床前動物實驗的放療儀器，其特點是在實施放療前，先對小動物進行精確的CT 三維成像，然后應用專門的軟件，運用蒙特卡洛算法制定放療計劃，最后按照制定好的放療計劃引導儀器對小動物實施精確的放療[3]。本文以美國Precision X-ray (PXi)公司生產的X-RAD SmART 小動物精準放療系統為例，闡述小動物精準放療系統在小鼠腫瘤放療模型中的應用。

X-RAD SmART 小動物精準放射治療系統基本結構包括自屏蔽主機、X 射線發生單元、動物平臺控制單元、成像單元、輻照單元、軟件控制單元，如圖1所示。

1.1 X 射線發生單元

（1）X 射線球管，最大管電壓225 kV，最大功率3 kW，雙焦點，焦點大小0.4 mm/3.0 mm（640 W/3 000 W），其中小焦點用于高分辨率成像，大焦點用于精確輻照；靶材料鎢；內過濾0.8 mm Be；冷卻介質純凈水。

（2）高壓發生器，最大輸出電壓225 kV，最小調節電壓0.1 kV；最大輸出電流45 mA，最小調節單位0.01 mA；最大輸出功率4.5 kW。

1.2 動物平臺控制單元

（1）控制模式：成像或輻照時，動物床固定不動，X 射線球管和探測器以動物床為軸做0°～360°圓周旋轉；旋轉速度可調節范圍0.01～3 r/min；旋轉定位精度6 arc/min。

（2）動物平臺可三軸向同時調節，X 軸和Y 軸可調節距離（距等中心位置）±12.5 cm；Z 軸可調節距離（距等中心位置）±10.5 cm；調節速率36 mm/s；定位精度≤35 μm；定位可重復性≤±20 μm；動物平臺可承受的動物的最大重量≤5.5 kg。

1.3 成像單元

（1）CT 成像，成像方式為標準的錐束CT 成像；等中心體積分辨率100 μm；等中心成像體積10 cm×10 cm×10 cm；成像和重建時間最快20 s；幾何線性0.5 mm（不小于100 mm 距離）；成像時產生的最小輻射劑量率≤1 cGy/min。

（2）平板探測器，類型CsI 非晶硅探測器；實際像素1024×1024；像素單元大小200 μm；成像面積20 cm×20 cm；成像幀率15 fps；定位精度，標準模式，±0.25 mm；高分辨率模式±0.1 mm。

1.4 輻照單元

輻照劑量率范圍 1～400 cGy/min；X 射線過濾0.2 mm Al（用于成像），0.3 mm Cu（用于治療）；限束器（固定照射野）規格1～5 mm，圓孔或矩形孔；各向等中心距30 cm SSD；三束激光定位系統，方便對放射治療區域的定位和標識；實時視頻監控系統，方便對放射治療全過程的監控。

1.5 軟件單元

放射治療計劃系統（TPS），CBCT 掃描工具和重建工具，3D CT 圖像的快速掃描和重建，最快速度20 s，最高分辨率100 μm，極大地縮短了整個放射治療的時間；數據庫管理工具，對獲取的每一幅圖像都建立獨立的識別碼，方便圖像的編輯、灰度匹配、分析、傳輸和分享；DICOM 輸入輸出工具，對不同平臺（MRI，PET-CT，SPECT-CT 等）的圖像數據可以分享和融合，進一步增強了放射治療計劃的精確性和可評估重復性；劑量工具，采用最先進的蒙特卡洛算法（Monte Carlo algorithms）進行劑量的計算、校準和評估。

圖1 X -RAD SmART 小動物精準放療系統

2 X -RAD SmART 小動物精準放療系統在小鼠腫瘤放療模型中的應用

X-RAD SmART 小動物精準放療系統能夠在小動物進行治療前、治療中利用CT 掃描單元對腫瘤及正常器官進行實時的監控，并能根據器官位置的變化調整治療條件使照射野緊緊“追隨”靶區，使之能做到真正意義上的精確治療。優點是通過三維的CT 成像，可精確地確定腫瘤在體內的空間位置、形狀和大小，據此設計精準的放療方案使得X 射線聚焦于腫瘤位置，并可以進行多角度的照射[4]。在小鼠腫瘤放療實驗中，一般常用的腫瘤模型是小鼠模型和人腫瘤裸鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下移植、腹腔注射移植、尾靜脈注射以及原位模型，本文以小鼠尾靜脈注射腫瘤細胞建立肺部移植瘤模型為例[5-6]。

2.1 實驗材料

SPF 級NOD/SCID 小鼠，雄性，6～8 周齡，體重18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；人源非小細胞肺癌A549 細胞株由蘇州大學哥倫比亞大學衛星實驗室提供；攜帶有熒光素酶報告基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒購于生工生物工程股份有限公司；D-螢光素鉀鹽購于碧云天生物技術有限公司；嘌呤霉素購于美國GIBCO 公司；Ki67 抗體購于碧云天生物技術有限公司。

2.2 小鼠腫瘤模型建立

首先將攜帶有熒光素酶報告基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體轉染非小細胞肺癌細胞系A549，然后使用含有嘌呤霉素的培養基篩選出能夠穩定表達熒光素酶的A549 細胞株。將生長旺盛的穩定表達細胞株，消化離心清除培養基，重懸于生理鹽水中，尾靜脈注射進小鼠體內，每只小鼠注射200 μL 生理鹽水，包含2×106個細胞，放回SPF 動物房，繼續養殖20天后，觀察小鼠肺部成瘤情況，并準備放射治療。

2.3 小鼠腫瘤模型的鑒定

小鼠注射上述能夠穩定表達熒光素酶的A549 細胞株20 d 后，將熒光素酶底物D-熒光素鉀鹽溶于生理鹽水中，配制成15 mg/mL 的D-螢光素鉀鹽溶液，按照10 μL/g 的體重濃度，通過腹腔注射入小鼠體內，5 min 后使用小動物成像儀觀察小鼠體內熒光分布，如圖2 所示，熒光主要富集在小鼠的肺部，提示腫瘤細胞進入小鼠血液循環后，大部分遷移至肺部成瘤。然后處死部分荷瘤小鼠，取出肺部，可以看到肺部表面突起了大小不一的腫瘤組織（見圖3），并制作石蠟病理切片，進行HE 染色，如圖4(a)所示，肺部彌散浸潤了大量的腫瘤灶，腫瘤區域與周圍正常肺癌細胞結構明顯不同。進一步通過免疫組化實驗，對細胞增殖相關抗原Ki67 進行染色，如圖4(b)所示，腫瘤部位著色明顯比正常組織深，顯示 Ki67 高表達。以上結果證明本實驗用的小鼠腫瘤模型建立成功，可以用于下一步放射治療。

圖2 小鼠腫瘤模型的活體成像

圖3 小鼠肺部腫瘤

圖4 小鼠腫瘤模型染色結果

2.4 放射治療

將已經成瘤的小鼠隨機分成兩組，每組10 只，一組為不照射對照組，另一組為放射治療組。放療條件為每隔6 d 照射一次，劑量率為2 Gy/min，一次照射4 Gy，共照射3 次，累積劑量12 Gy，觀察小鼠從第一次放療起，30 d 內的生存率。照射方法：腹腔注射水合氯醛將小鼠麻醉，然后將小鼠放置在 X-RAD SmART 放射治療系統的小動物床上，通過CT 控制軟件，對小鼠進行CT 成像，然后在所成三維圖像上畫出照射靶區；再通過放療控制軟件，設置照射劑量，計算照射時間，并開始照射（見圖5）。

圖5 小鼠腫瘤模型的肺部CT 掃描照片和肺部腫瘤放療靶區的確定

圖6 放射治療組與未治療對照組30 d 內的生存率比較（“↑”表示照射X 射線）

2.5 實驗結果分析

連續3 次放療結束后，統計小鼠放療后30 d 的生存情況，如圖6 所示，未進行放射治療的小鼠，因為肺部腫瘤不斷增殖惡化，第30 d 小鼠的存活率僅為20%，而給予放射治療的小鼠，存活率為80%，說明放射治療能夠顯著抑制腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存期。

3 小動物精準放療系統的其他應用

X-RAD SmART 小動物精準放療系統是專為臨床前應用和研究而設計的精準放射治療系統非常類似于臨床放療系統，即生物樣本保持靜止，檢測器圍繞樣本360°旋轉。這樣就能夠精確快速執行在復雜3D 圖像引導下的精確治療，為腫瘤放射治療、放射生物學研究提供了高效率的臨床前研究平臺，可以加速臨床轉化進程。目前，X-RAD SmART 廣泛用于臨床前的基礎和轉化輻射生物學研究、腫瘤放射治療研究等很多領域，包括：放射治療的臨床前驗證、評估輻照風險、放射生物學效應研究、DNA 損傷應答研究、旁觀者效應研究、輻射增敏劑研發、評估正常組織并發癥概率、腦和神經及其他組織結構和功能的研究、藥物有效性的研究[7-8]。

4 結語

放射治療在癌癥治療過程中扮演著非常重要的角色，無論是早期還是晚期的病灶。隨著醫學技術的發展，新的放射治療方法也不斷地更新，目前臨床治療癌癥的放射療法有立體消融照射療法（SABR）也稱作立體全身照射療法（SBRT）、強度調節照射療法（IMRT）、三維適形放療（3D-CRT）、網狀照射方法（GRID）等[9-13]。但是單獨使用放射治療很難有效控制癌癥發展，甚至聯合最好的化療藥物治療效果仍不理想。近幾年，大量研究者報道了免疫療法與傳統的放射療法相結合用于治療腫瘤具有良好的效果[14]。而精準放療聯合其他癌癥治療方法的前期基礎研究，需要做大量動物實驗驗證，本文以小鼠肺癌放療模型為例，闡述了小動物精準放療系統在動物實驗中應用，為研究放射治療與其他方法治療癌癥的協同效應提供實驗技術方案。