常量法和微量法測定蛋白質含量綜合性實驗設計

趙玉榮，陳翠霞，張黎民，李幸凡，王文鑫

（中國石油大學（華東） 化學工程學院，山東 青島 266580）

實驗教學在化學和生物學科教學中承擔著不可替代的作用，是學生從事科研工作的基礎。綜合性設計實驗有利于將傳統的實驗教學“以教師為中心”的模式轉變為“以學生為中心”的模式。綜合實驗的開展有助于提高學生查閱文獻和歸納總結的能力，是提高學生創新能力的重要途徑之一[1-2]。蛋白質是組成人體細胞的基本成分，機體的重要生命活動都需要蛋白質的參與，它是生命活動的主要承擔者[3-4]。蛋白質測定是指通過物理或化學方法對蛋白質含量進行測定，是生物化學和分子生物學研究中最常用的基本分析方法之一。測定蛋白質含量的方法包括凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍法（Bradford 法）等。其中，Bradford 法因具有靈敏度高、測定快速簡便和干擾物少等優點備受關注[5-11]?；贐radford 法測定蛋白質含量的實驗是生物化學本科教學實驗的重要組成部分，但實驗一般基于一種方法進行，往往導致兩方面問題：一方面，學生不能很好地掌握常量法和微量法的區別；另一方面，單一儀器的應用很難解決多分組實驗擁擠等資源緊張的問題?；诖?，本文設計了利用紫外分光光度計（常量法）和多功能酶標儀（微量法）同時進行蛋白質含量測定的綜合性實驗。這種方法是根據蛋白質與染料相結合時產生復合物導致染料的顏色發生變化的原理設計的，如圖1 所示。

圖1 Bradford 法測定蛋白質含量的原理示意圖

染料考馬斯亮蘭G-250（二甲花青亮藍）的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465 nm，在酸性條件下其可與蛋白質中的精氨酸和芳香氨基酸結合，形成復合物時，溶液呈現淺藍色，導致染料的最大吸收峰的位置變為595 nm。在一定范圍內，595 nm 處測定的吸光度值A595與蛋白質含量呈線性關系，因此可以用于蛋白質含量的測定[5-11]。

紫外分光光度計[12]和多功能酶標儀[13-15]都是測量吸光度的儀器，但原理存在一定差異。紫外分光光度計在測量過程中可以通過設置特定波長的單色光直接作用于樣品（見圖2(a)），進而測得其在特定波長的吸光度；而多功能酶標儀則首先通過一定波段的濾光片獲得目標波段，經過光路改變器改變入射光的方向，從頂部垂直照射在樣品上（見圖2(b)），進而測得樣品的吸光度。另外，兩種測量方法使用的樣品池不同，紫外分光光度計測定吸光度一般用常量石英比色皿樣品池，而多功能酶標儀則使用微量孔板（如96 孔板或384 孔板），使用移液槍將樣品轉移到孔板中。由于測量樣品的體積不同，上述兩種方法分別被稱為常量法和微量法。相比于紫外分光光度計，多功能酶標儀根據用途的特殊性限定了范圍和設置界面，快速且簡便。同時，多功能酶標儀可同時在短時間內檢測幾十組樣品，工作效率大大提高，這可保證不同樣品在相同靜置時間和儀器狀態下進行測定。

圖2 紫外分光光度計和多功能酶標儀的工作原理

本實驗首先配制了不同濃度的蛋白溶液并進行了吸光度測定，在此基礎上繪制標準曲線方程，隨后對未知樣品進行測定，將其吸光度值代入標準曲線方程即可求得未知樣品中的蛋白含量。在此基礎上，考察了SDS 對蛋白質含量測定的影響并分析了原因。實驗中，將學生分為兩組，在測量蛋白質含量和SDS 干擾時僅選擇一種儀器進行試驗即可。這樣，每組學生均可使用兩種儀器進行吸光度測定，有助于拓寬學生的知識面。

本實驗同時利用紫外分光光度計和多功能酶標儀開展實驗，一方面，有助于學生同時掌握常量法和微量法測定蛋白質含量，了解上述兩種儀器工作原理、操作流程和使用方法，為今后從事科研工作奠定基礎。另一方面，由于多功能酶標儀和紫外分光光度計的配合使用，將大大提高多分組實驗的測量效率，同時有助于學生學習和使用移液槍等常用工具，非常適合作為綜合性實驗向本科生開設。

1 實驗部分

1.1 實驗目的

（1）掌握考馬斯亮藍染色法定量測定蛋白質含量的原理與方法。

（2）熟練紫外分光光度計和多功能酶標儀的使用和操作方法。

（3）了解紫外分光光度計和酶標儀測量方法的異同點。

1.2 實驗藥品與實驗儀器

實驗藥品：牛血清蛋白BSA（純度98%，Sigma）；考馬斯亮藍G-250（99.9%，Sigma）；乙醇（99%，上海國藥）；85%的磷酸溶液（上海國藥）；SDS（98%，Sigma）。

實驗儀器：紫外光分光光度計/多功能酶標儀；漩渦混合器；容量瓶；量筒；電子分析天平；EP 管/96孔板；試管架；移液槍；一次性槍頭。

1.3 溶液配制

（1）配制1 mg/mL BSA 標準蛋白質溶液：稱量BSA 100 mg，用超純水溶解并稀釋至100 mL。

（2）配制0.01%（w/w）的考馬斯亮蘭G-250 染料溶液：稱量100 mg 的考馬斯亮蘭，先溶于50 mL 95%的乙醇，再加入85%的磷酸溶液120 mL，用超純水稀釋至1 000 mL。

（3）不同濃度的樣品液：取1 mg/mL 的BSA 母液，用超純水稀釋到所需濃度。

（4）配制SDS 100 μg/mL 的SDS 溶液：稱量SDS粉末10 mg，加入超純水溶解并稀釋至100 mL。

表1 考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度-標準曲線的繪制所需樣品的組分

1.4 實驗方法

1）常量法和微量法測定蛋白質含量。

（1）取9 支試管，按表1 分別編號后依次加入標準蛋白（或未知蛋白）、去離子水和考馬斯亮蘭染料溶液，加完后立即在漩渦混合器上混合。

（2）上述混合后的樣品室溫下靜置3 min，兩組同學分別使用紫外分光光度計和多功能酶標儀測定樣品在595 nm 處的吸光度A595（使用紫外分光光度計時，選擇石英比色皿為樣品池，以第一管為空白，加入一定體積的溶液；使用酶標儀時，取96 孔板，依次按照編號用移液槍移取樣品200 μL 至對應孔中，每個樣品平行測定5 組求平均值）。

（3）分別以蛋白濃度和A595為橫坐標和縱坐標作圖并進行直線擬合，得到標準曲線方程（Y=aX+b）。

（4）測量未知蛋白樣品的吸光度A595，將測量值代入標準曲線方程，即可求得未知樣品中的蛋白含量。

2）SDS 干擾試驗。

（1）取7 支試管，分別編號后按表2 劑量依次加入標準蛋白、SDS、超純水和考馬斯亮蘭染料溶液。每支試管加完后，立即在漩渦混合器上混合。

（2）將上述溶液混合后靜置3 min，使用紫外分光光度計或多功能酶標儀（本文僅使用紫外分光光度計進行測量），測量595 nm 處吸光度A595。分別以A595和SDS 濃度為縱、橫坐標作圖，繪制SDS 干擾試驗的曲線，在此基礎上分析其干擾機理。

表2 測定SDS 干擾實驗曲線的樣品編號及不同成分的含量

圖3 通過常量法（紫外分光光度計）測量的標準曲線

2 結果與討論

2.1 常量法測定蛋白質含量

首先利用常量法測定了蛋白質含量，通過紫外分光光度計測量了表1 中不同濃度的BSA 溶液與染料作用后在595 nm 處的吸光度值，作為縱坐標，BSA 濃度為橫坐標進行作圖，繪制標準曲線并進行擬合，如圖3 所示。通過擬合曲線得到相關系數R2為0.996 72，相關性好，可用于進一步標定和計算未知蛋白質的濃度。此時，本文進一步對未知蛋白1 和2 進行測定，其在595 nm 處的吸光度值分別為0.543 和0.760，代入標準曲線方程得出未知蛋白濃度為12.62 μg/mL 和18.63 μg/mL。

2.2 微量法測定蛋白質含量

隨后利用微量法測定了蛋白質的含量，通過酶標儀同時測量了表1 不同濃度的BSA 溶液與染料作用后在595 nm 處的吸光度值（每組樣品平行測定5 個孔求平均值），以其為縱坐標，BSA 濃度為橫坐標進行作圖，繪制了標準曲線并進行擬合，如圖4 所示。通過擬合曲線得到相關系數R2為0.998 08，相關性好，可用于進一步標定和計算未知蛋白質的濃度。此時，進一步對未知蛋白 1 和 2 進行了吸光度測定，其在595 nm 處的吸光度值分別為0.323 和0.430，代入標準曲線方程得出未知蛋白濃度為 14.70 μg/mL 和20.15 μg/mL，與通過常量法測得的數據相比，更接近未知蛋白的實際濃度15 μg/mL 和20 μg/mL，這主要是由于多功能酶標儀在測量過程中使用孔板，每次可同時測定多個樣品，每個樣品可平行測定多組，保證了同樣的儀器狀態和樣品放置時間，一定程度上提高了測量的準確度，且大大提升了測量效率。但由于孔板的利用，也會導致實驗成本相對增加。

上述結果表明，盡管常量法和微量法均可用于蛋白質含量測定，但兩種方法的測量原理、所需樣品量、測量效率以及測量準確度均存在差異，研究中需要根據實際情況進行選擇。當需要測量的樣品數量多，體積小時，應該選擇多功能酶標儀利用微量法進行測定；而當樣品數量較少，樣品體積較多時，可選擇紫外分光光度計用常量法進行測定。如果樣品數量和體積居中，可以依據實驗對測量準確度和實驗成本等因素的要求選擇其中一種方法進行測試或選取兩種方法平行驗證。

圖4 通過微量法（酶標儀）測量的標準曲線

2.3 SDS 對蛋白質含量測定的干擾

盡管Bradford 法具有很多優點，但也存在一定缺點，如一些物質存在會干擾測量的準確性，這些物質主要包括去污劑、Triton X-100 和SDS 等，本部分考察了SDS 對蛋白質含量測定的干擾。利用常量法對表2的樣品進行了測定，分別以吸光度和SDS 濃度為縱、橫坐標進行作圖，結果如圖5 所示。

圖5 SDS 對蛋白質含量測定的干擾曲線

從上圖可以看出，SDS 可顯著干擾蛋白質含量測定，測量結果表明：吸光度隨SDS 濃度的增加出現了先減小后增大的現象，造成上述結果的主要原因是，SDS 可以有效斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質的二級結構和三級結構，同時，當SDS 與蛋白質結合后會形成蛋白質-SDS 復合物，導致蛋白質帶上大量的負電荷，阻礙染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的有效結合，導致吸光度降低。而當SDS 加入蛋白質溶液后，導致蛋白質變性，又會使蛋白質的空間結構更加伸展，使原來一些包裹在結構中未與染料結合的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來，促進染料與蛋白質的結合，因此導致測量結果出現先增加后減小的情況。

3 實驗教學模式與內容拓展

本實驗將常量法和微量法結合用于蛋白質含量的測定，分析了兩種方法的異同點。在此基礎上，考察了SDS 對蛋白質含量測定的干擾，發現隨著SDS 含量的增加，蛋白濃度出現了先增加后減小的情況，這主要是由于靜電作用和蛋白質變性兩方面的因素造成。通過本實驗的開展，可實現如下目標：

（1）學生可掌握Bradford 法測定蛋白質含量的方法和原理，即染料單體與復合物顏色不同，分別在465 nm 和595 nm 處存在吸收。

（2）學生可掌握紫外分光光度計和多功能酶標儀的使用方法和原理，了解常量法和微量法測定的異同點。同時紫外分光光度計和酶標儀的綜合運用可提高測量效率，解決本科實驗室人數多、大型實驗儀器相對較少的問題。

（3）處理數據的過程中，學生可掌握利用Origin處理數據并進行標準曲線擬合的方法，提高學生的數據處理能力。而針對測量結果，特別是SDS 干擾實驗，有助于學生理解氨基酸的電性和蛋白質變性等生物化學中的重要概念和知識點，提高學生分析問題和解決問題的能力。

（4）由于不同分組之間需要協調紫外分光光度計和多功能酶標儀的使用，該實驗需要學生協作完成，這可有效提高學生的合作和溝通能力，為今后的科研工作奠定良好的基礎。