當歸多糖促進大鼠心肌細胞系H9c2增殖

楊 萍，代 天，張蘇川

(江漢大學附屬醫院(武漢市第六醫院)心血管內科, 湖北 武漢 430015)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy)是一種嚴重的疾病，特征是心室擴張和心臟功能障礙。作為人類最常見的心肌病形式，擴張型心肌病約占所有心肌病的60%，也是心力衰竭和心臟移植的主要原因[1-2]?，F階段，擴張型心肌病的臨床治療尚未獲得令人滿意的結果，并且患者的預后極差，其5年生存率低于50%[3-4]。因此，有必要進一步開發新的治療策略來改善擴張型心肌病。當歸是一種常用的中藥，具有造血、抗氧化、抗感染、免疫調節、抗細胞凋亡和抑制血小板聚集的藥理活性[5]。當歸多糖(angelica polysaccharide，APS) 是從當歸根中提取的主要的水溶性成分，可以通過激活化轉錄因子6(activating transcription factor-6，ATF6)減輕內質網應激誘導的大鼠心肌細胞系H9c2凋亡，從而保護心臟免受缺血性損傷[5]。當歸多糖還能以濃度依賴方式減少缺氧-復氧誘導的H9c2心肌細胞凋亡，改善細胞的氧化應激損傷[6]。但是，目前尚無有關當歸多糖對擴張型心肌病影響及機制的報告。微小RNA(microRNA，miRNA)-4701-3p是重要的miRNA之一，其調節功能已在各種癌中被報道[7]。既往研究表明，miR-4701-3p在擴張性心肌病患者中相較于正常對照高表達[8]。但是，miR-4701-3p是否參與當歸多糖對擴張性心肌病大鼠心肌細胞的調節仍不清楚。因此，本研究以大鼠心肌細胞H9c2為對象，利用阿霉素(adriamycin，ADR)誘導心肌細胞損傷，模擬擴張型心肌病，評價當歸多糖在細胞增殖和凋亡中的功能及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系與試劑

鼠源H9c2細胞系(中科院上海細胞庫)，當歸多糖APS(Solarbio公司)；ADR(輝瑞制藥有限公司)；Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)培養基(Gibco公司)；anti-miR-4701-3p及陰性對照anti-miR-NC(廣州銳博公司)；B型腦鈉肽(B-type natriuretic peptide, BNP)酶聯免疫(ELISA)試劑盒(北京華英生物技術研究所)；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒(BestBio公司)；抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)、抗Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、抗細胞核相關抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67, Ki-67)、抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體(Abcam公司); 實時定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)相關試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組與處理：用含10%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗的DMEM培養基，在飽和濕度、37 ℃和5% CO2的細胞培養箱中常規培養H9c2細胞。將H9c2細胞分為對照組(control組)、ADR誘導H9c2細胞復制擴張性心肌病心肌細胞組(ADR組)。當歸多糖(angelica polysaccharide，APS)干預(APS組)、轉染anti-miR-NC(APS+anti-miR-NC組)及轉染anti-miR-4701-3p(APS+anti-miR-4701-3p組)。轉染時按照Lipofectamine 2000轉染試劑的步驟，在細胞匯合至60%的H9c2細胞中轉染anti-miR-4701-3p和anti-miR-NC，根據分組進行其他處理。其中，control組為正常培養的細胞，ADR組用3 mg/L ADR作用H9c2細胞12 h，APS組用250 mg/L當歸多糖預處理細胞24 h，之后進行ADR損傷，APS+anti-miR-NC組或APS+anti-miR-4701-3p組細胞轉染anti-miR-NC或anti-miR-4701-3p,使用250 mg/L當歸多糖處理24 h后，進行ADR損傷。

1.2.2 流式細胞計量術檢測細胞凋亡：收集各組H9c2細胞，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，在400 μL結合緩沖液中懸浮細胞，將細胞濃度調整為1×106個/mL。之后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4 ℃避光反應15 min，加入10 μL PI并輕輕混勻，于4 ℃避光反應5 min，置流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

1.2.3 Western blot檢測Bcl-2、Bax、Ki-67、PCNA表達:向各組H9c2細胞中加入RIPA裂解液，進行蛋白的提取。將提取的蛋白于沸水中變性10 min，并吸取30 μg進行12%的SDS-PAGE電泳，轉膜。膜用5%脫脂奶粉封閉液封閉，之后與抗Bcl-2、抗Bax、抗Ki-67、抗PCNA和抗β肌動蛋白(β-actin)一抗，在4 ℃條件下孵育過夜。第2天，將膜與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG一起孵育2 h，再通過ELC化學發光液顯色、顯影，通過Image J軟件分析Bcl-2、Bax、Ki-67、PCNA蛋白的水平。

1.2.4 ELISA法檢測BNP水平：構建擴張性心肌病大鼠心肌細胞模型時，收集control組和ADR組H9c2細胞上清液，按照ELISA試劑盒的說明，檢測BNP水平。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖:收集各組H9c2細胞，以1×104個/孔的數量接種于96孔板，向培養48 h后的細胞中加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h，于酶標儀測定細胞在450 nm波長處的吸光度A值，來表示細胞活力。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-4701-3p表達:收集各組H9c2細胞，加入Trizol試劑提取細胞總RNA。通過PrimeScriptTMRT試劑盒進行反轉錄，得到cDNA。通過SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行PCR反應。miR-4701-3p的表達以U6為參照，由2-ΔΔCt方法計算得出。miR-4701-3p引物序列為5′-CCACCACAC CTACCCCTTGT-3′(F)和5′-ACACCACACCCATCAC CCAT-3′(R)，U6引物序列為5′-CTGGTAGGGT GCTCGCTTCGGCAG-3′(F)和5′-CAACTGGTGTC GTGGAGTCGGC-3′(R)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 阿霉素誘導大鼠心肌細胞H9c2凋亡

與對照組比較，ADR組H9c2細胞中BNP含量、細胞凋亡率和Bax蛋白水平顯著升高，而Bcl-2蛋白表達量明顯降低(P<0.05)(圖1)。

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the relative expression of Bcl-2 and Bax protein;*P<0.05 compared with control group

2.2 當歸多糖對擴張性心肌病大鼠心肌細胞H9c2增殖的影響

與ADR組比較，APS組H9c2細胞的Ki-67、PCNA蛋白表達量顯著升高，細胞活力明顯增加(P<0.05)(圖2)。

2.3 當歸多糖對擴張性心肌病大鼠心肌細胞H9c2凋亡的影響

與ADR組比較，APS組細胞的凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達量明顯增加，Bax蛋白表達量顯著減少(P<0.05)(圖3)。

2.4 當歸多糖對miR-4701-3p在擴張性心肌病大鼠心肌細胞H9c2中表達的影響

APS組H9c2細胞中miR-4701-3p表達量為1.62±0.16，顯著高于ADR組的1.00±0.09(P<0.05)。

2.5 敲減miR-4701-3p對當歸多糖作用的擴張性心肌病大鼠心肌細胞H9c2增殖的影響

與APS組比較，APS+anti-miR-NC組細胞H9c2的Ki-67、PCNA蛋白表達量、細胞活力、miR-4701-3p表達量無明顯變化； APS+anti-miR-4701-3p組H9c2細胞內Ki-67、PCNA蛋白水平明顯降低，細胞活力顯著降低，miR-4701-3p表達量明顯減少(P<0.05)(圖4)。

A.MTT detected cell viability; B.Western blot to detect the relative expression Ki-67 and PCNA protein; *P<0.05 compared with ADR group

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the relative expression of Bcl-2 and Bax protein;*P<0.05 compared with ADR group

2.6 敲減miR-4701-3p對當歸多糖作用的擴張性心肌病大鼠心肌細胞H9c2凋亡的影響

與APS組比較，APS+anti-miR-NC組細胞H9c2的凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平無顯著變化；APS+ anti-miR-4701-3p組細胞H9c2的凋亡率明顯增加，Bcl-2蛋白表達量顯著減少，Bax蛋白表達量明顯升高(P<0.05)(圖5)。

3 討論

現階段，擴張型心肌病的病因和發病機制仍不清楚。本研究采用阿霉素誘導大鼠心肌細胞H9c2損傷，以構建擴張型心肌病模型[9]，結果發現，阿霉素的使用導致心肌細胞H9c2的凋亡率和促凋亡蛋白Bax的蛋白表達量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達量減少，并且，細胞中BNP含量升高，與報道[10-11]相符，因此，后續實驗在此模型的基礎上探討當歸多糖的作用和機制。

當歸多糖在心臟疾病方面表現出一定的預防和治療作用，例如缺氧-復氧導致H9c2心肌細胞凋亡增加，而當歸多糖可以起到減少其凋亡，產生保護缺氧-復氧損傷心肌細胞的效果[12]。在缺氧條件下，當歸多糖的預處理通過下調miR-22的表達，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，從而減輕H9c2細胞損傷[13]。然而，當歸多糖對阿霉素損傷大鼠心肌細胞H9c2的保護作用尚未得到充分報道。本實驗中，當歸多糖可以增加阿霉素誘導后H9c2細胞的細胞活力，并減少細胞的凋亡，提示當歸多糖可能對阿霉素誘導的大鼠心肌細胞H9c2損傷發揮保護和治療作用。

以前的研究證明了miR-4701-3p在擴張性心肌病患者中高表達[8]。結直腸癌HCT116中的miR-4701-3p被異惡唑衍生物SHU00238顯著下調，miR-4701-3p可以逆轉SHU00238對HCT116細胞凋亡的影響[14]。這項研究首次揭示了，當歸多糖處理明顯上調了阿霉素誘導的H9c2細胞中miR-4701-3p的表達水平。更重要的是，敲減miR-4701-3p明顯減弱當歸多糖作用的擴張性心肌病H9c2細胞的細胞活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平，而增強其凋亡率、Bax蛋白表達量，可見當歸多糖預處理對阿霉素誘導的H9c2細胞的保護作用被敲減miR-4701-3p所逆轉。綜合這些結果，說明當歸多糖通過上調miR-4701-3p，使細胞增殖增加和細胞凋亡減少，來保護H9c2細胞免受阿霉素誘導的損傷。

A.qRT-PCR detected the expression of miR-4701-3p; B.MTT detected cell viability; C.Western blot to detect the relative expression of Ki-67 and PCNA protein; *P<0.05 compared with APS group

A.flow cytometry to detect cell apoptosis; B.Western blot to detect the relative expression of Bcl-2 and Bax protein;*P<0.05 compared with APS group

總之，當歸多糖對阿霉素誘導的擴張型心肌病H9c2細胞損傷模型具有保護作用。當歸多糖的預處理可通過上調miR-4701-3p，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡來保護心肌細胞免受阿霉素誘導的損傷。這為了解當歸多糖的心肌保護作用提供了證據，并為深入探討使用當歸多糖預防和治療擴張型心肌病提供了理論依據。