調節神經元CREB磷酸化水平對APP和γ分泌酶的影響

邸暢 李國萍 羅浩丹 畢珊 孫欣 陳紹春，3

(昆明醫科大學 1基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，云南 昆明 650500；2第三附屬醫院頭頸外科；3康復學院)

γ分泌酶復合體是阿爾茨海默病(AD)中形成β淀粉樣蛋白(Aβ)的關鍵酶，它通過對β分泌酶切割Aβ前體蛋白(APP)形成的含有99個氨基酸的C端片段(C99)再切割形成Aβ〔1〕。而γ分泌酶復合體中起主要催化作用的部分是早老素(PS)1蛋白，PS1在早老素增強子(PEN2)的存在下會被水解為兩段而發揮對C99的剪切作用〔2〕。當用抑制劑γ-分泌酶抑制劑抑制γ分泌酶的功能時，PS1的表達量反而升高〔3〕。環磷酸腺苷(cAMP)反應原件結合蛋白(CREB)一直認為是形成和維持長期記憶的關鍵蛋白，它的表達量及磷酸化水平一直被作為記憶能力變化的指標，而在AD中長期記憶的喪失是患者生活不能自理的重要原因〔4〕。Aβ以單體形式存在可以增加CREB的產生，而Aβ產生的低聚物及老年斑是破壞神經元導致癡呆的重要原因〔5〕。Aβ1～40與Aβ1～42的比例失衡被認為是導致淀粉樣變性及老年斑的關鍵原因〔6〕。當突變激活CREB的上游基因啟動子表達，CREB的表達量上升的情況下，PEN2蛋白的表達量隨之上升〔7〕。而抑制蛋白激酶(PK)A-CREB-腦源性神經營養因子(BDNF)通路時大鼠表現出長期的空間學習和記憶障礙〔8〕。既往研究多將CREB作為評價記憶能力變化的分子指標，而很少將其作為AD發生發展和防控的初始因素進行研究。本文旨在通過使用CREB激動劑和抑制劑干預CREB在人神經元樣細胞株SY5Y中的磷酸化水平，探討CREB磷酸化水平的變化對APP及γ分泌酶復合體的影響。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM 培養基、胎牛血清、F12培養基購自美國Gibco公司； 0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素購自美國Hyclone公司；Forskolin和H 89 2HCL購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 空載體SY5Y細胞株(Vector-SY5Y)、過表達Gαq的SY5Y細胞株(Gαq-SY5Y)、過表達APP的SY5Y細胞株(APP-SY5Y)委托上海漢恒生物科技有限公司構建，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，培養條件為37℃、5%CO2濃度。

1.2.2CREB激活/抑制實驗 cAMP激動劑Forskolin激活CREB的磷酸化，用PKA抑制劑H 89 2HCL抑制CREB的磷酸化，根據產家的操作指南和推薦濃度，用二甲基亞砜(DMSO)完全溶解Forskolin和H 89 2HCL，分別控制實驗的終濃度Forskolin為35 μmol/L、H 89 2HCL 為30 μmol/L。用25 ml培養瓶培養細胞至70%匯合度，棄除培養液，分別加入含H 89 2HCL(30 μmol/L)的培養液、單純培養液、含Forskolin(35 μmol/L)的培養液2 ml至不同組細胞，繼續培養12 h，收集細胞提取蛋白進行后續實驗。

1.2.3Western印跡實驗 收集細胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解10 min，10 000 r/min、4℃離心30 min后取上清即為細胞總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白質的濃度。取30 μg總蛋白于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠中電泳分離，之后轉膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h。1∶1 000稀釋的兔抗人CREB、p-CREB、PEN2、PS1-CTF、APP、GAPDH等抗體(均購自CST公司，美國)并于4℃孵育PVDF膜12 h，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h，采用化學發光成像系統成像。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1在Vector-SY5Y細胞中應用CREB激動劑和抑制劑之后有關蛋白水平比較 與對照組比較，激動劑組中總CREB、APP的表達無明顯差異，p-CREB、PEN2、PS1-CTF的表達明顯上調(P<0.05)；抑制劑組中總CREB、PEN2、PS1-CTF變化不明顯，APP的表達明顯上調，p-CREB明顯下調(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2在Gaq-SY5Y細胞中應用CREB激動劑和抑制劑之后有關蛋白水平比較 與對照組比較，激動劑組中總的CREB水平無明顯變化，p-CREB、PEN2表達量明顯上調，APP及PS1-CTF明顯下降(P<0.05)；抑制劑組中總的CREB、PS1-CTF水平均無明顯變化，p-CREB、PEN2、APP表達明顯下降(P<0.05)，見表1、圖2。

圖1 Vector-SY5Y細胞使用CREB抑制劑與激動劑處理后有關蛋白表達

2.3在APP-SY5Y細胞中應用CREB激動劑和抑制劑之后有關蛋白水平比較 與對照組比較，激動劑組中總CREB、APP變化不明顯，PS1-CTF表達明顯下降，p-CREB、PEN2表達明顯上調(P<0.05)；抑制劑組中總CREB表達量明顯增加，p-CREB變化不明顯，PEN2表達明顯下降，PS1-CTF、APP表達量明顯上升(P<0.05)，見表1、圖3。

圖2 Gaq-SY5Y細胞使用CREB抑制劑與激動劑處理后有關蛋白表達

圖3 APP-SY5Y細胞使用CREB抑制劑與激動劑處理后有關蛋白表達

3 討 論

CREB在大腦所有細胞中都有表達，CREB參與學習和長期記憶的形成，是作為轉錄因子發揮作用的蛋白質家族中的一員。轉錄因子(如CREB)對啟動轉錄耦聯起著至關重要的作用，其將發生在細胞膜上的事件傳遞至細胞核并引起基因表達的改變〔9〕。CREB轉錄因子家族的成員包括轉錄增強子(CREB 1)和抑制子(CREB 2)，并與許多信號蛋白相互作用，介導從短期記憶到長期記憶的轉變〔10〕。AD 是最常見的癡呆類型，占所有癡呆患者 60%～80%〔4〕。

Aβ的聚集和沉積不僅會破壞突觸結構和功能，也會導致神經細胞凋亡，從而導致記憶和認知功能障礙〔11〕。在AD模型Tg2576基因突變小鼠腦組織免疫組化分析顯示海馬和皮層CREB水平降低。轉基因小鼠腦組織中檢測到氧化應激標志物，顯示星形膠質細胞豐富的區域CREB染色減少〔12〕。在AD患者死后海馬標本中，Aβ與CREB蛋白水平也呈負相關，由此可見CREB在AD中是減少的〔13〕。用福斯克林激活CREB(使其磷酸化)，可顯著促進PEN2 的mRNA轉錄和蛋白的表達，而對γ-分泌酶復合物的其他組分沒有影響〔7〕。當PS-1基因突變導致PS-1和PEN2聯系減少，Aβ42/Aβ40比例升高，但不影響γ分泌酶的功能和PS-1的內分解，也不影響Notch信號通路，即當PEN2表達量降低時Aβ42/Aβ40比例升高〔14〕。而在癡呆小鼠模型中使用γ分泌酶抑制劑，加重了小鼠的記憶障礙〔15〕。這也從側面說明了Aβ42可能在記憶形成中具有重要作用。

基于CREB在長期記憶形成中的重要作用及γ分泌酶復合體重要成分PS1、PEN2在Aβ生成和AD發生發展中的重要角色，且諸多文獻顯示CREB的改變在AD的發病中一直是作為記憶力變化的指標，而CREB的減少到底是因還是果卻沒有具體的研究表明。本研究結果說明，CREB不僅可以作為記憶力變化的指標，也可能是AD防治的重要靶點。Gαq蛋白是異源三聚體 G 蛋白 α 亞基中的一種，在大腦內廣泛表達。課題組前期研究發現，在 SAMP8 早衰小鼠腦皮質中，Gαq 隨著小鼠年齡的增長而減少〔16〕，這提示 Gαq 的表達水平與腦衰老相關。進一步研究發現，SY5Y 細胞中過表達 Gαq 發揮了明顯的抗氧化損傷作用〔17，18〕。本研究結果提示Gαq能與外源性CREB激活劑協同作用，從源頭上減少APP的生成。