益氣通絡方對糖尿病周圍神經病變大鼠HMGB1表達的影響

姜立娟 周曉晶 李欣 李玉國 崔巍 張文風 (長春中醫藥大學，吉林 長春 130000)

糖尿病周圍神經病變(DPN)是糖尿病最為常見且嚴重的并發癥之一，其起病隱匿，常被忽視〔1〕，臨床表現為四肢遠端出現對稱性感覺和運動神經障礙，并伴有麻木、疼痛、灼熱、蟻行感等，嚴重者可導致糖尿病足部潰瘍、感染甚至壞死、癱瘓〔2〕。DPN發病機制異常復雜，至今仍未有完全清晰的闡釋，主要涉及糖代謝紊亂、脂代謝異常、炎癥反應、氧化應激損傷、糖基化產物蓄積、蛋白激酶C信號通路異常調控等諸多方面，治療方向主要為控制血糖和改善疼痛〔3〕。DPN是消渴病之變證，可歸屬于中醫學“痹病”“血痹”“絡病”等范疇，消渴日久，氣陰兩虛，脈絡瘀阻是其病機關鍵，治宜益氣養陰，活血通絡〔4〕。本文通過建立DPN大鼠模型，觀察益氣通絡方對大鼠體重、空腹血糖(FBG)、坐骨神經中高遷移率族蛋白(HMG)B1蛋白及基因表達水平的影響，探討其對DPN的治療效果及改善DPN的可能機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 70只雄性健康SPF級SD大鼠，平均體重(180±20)g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證號:SCXK(遼)2015-0001。

1.2主要藥物及試劑 益氣通絡方由黃芪12 g、葛根12 g、生地10 g、當歸10 g、桂枝10 g、地龍5 g組成,購自北京同仁堂紅旗街店，并經長春中醫藥大學藥學院翁麗麗教授鑒定為正品，符合2015年版《中華藥典規范》。格華止鹽酸二甲雙胍片(購自吉林大藥房博碩路店)。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，購自北京博愛港股份有限公司，產品批號20190505)。RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)及HMGB1引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)，抗大鼠HMGB1單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3儀器與設備 血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)，臺式低溫高速離心機(美國Sigma公司)，Medlab生物信號采集處理系統 (南京美易科技有限公司)，全自動酶標儀(BioTek Elx808)，PCR擴增儀〔TC-48/T/H(a),美國〕，熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.4模型建立及分組 將60只SD大鼠，適應性喂養1 w，造模前禁食12 h后，按照55 mg/kg左下腹腔注射1%的STZ溶液，注射30 min后正常喂水喂食，72 h后取尾靜脈血檢測FBG，若FBG≥16.7 mmol/L即視為造模成功，并取同批次FBG在正常范圍(4.7～8.3 mmol/L)的大鼠10只作為正常對照組。造模后，將56只造模成功大鼠隨機分為模型對照組、益氣通絡方高劑量組、益氣通絡方低劑量組和西藥對照組，每組14只。造模成功后即按照人與大鼠體表面積換算法計算給藥劑量進行灌胃給藥，益氣通絡方低、高劑量組分別給予益氣通絡方1.84 g/(kg·d)、7.36 g/(kg·d)，西藥對照組給予二甲雙胍140 mg/(kg·d)，模型對照組和正常對照組給予等量的0.9% NaCl溶液灌胃，干預12 w，平時注意觀察大鼠狀態，每周定期檢測FBG和體重。電子天平稱取大鼠體質量；三諾血糖儀檢測大鼠尾靜脈血糖。

1.5Medlab生物信號采集處理系統檢測各組大鼠坐骨神經傳導速度 按照30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉成功后，取俯臥位固定，用玻璃分針鈍性分離大鼠右側坐骨神經，應用Medlab生物信號采集處理系統對大鼠坐骨神經傳導速度進行檢測〔5〕。

1.6免疫組化法檢測各組DPN大鼠坐骨神經HMGB1蛋白表達水平 將固定于4%多聚甲醛溶液中的各組坐骨神經標本制成石蠟切片并脫蠟至水。微波熱修復抗原，為保證染色的特異性，將內源性過氧化物酶滅活，滴加抗大鼠HMGB1單克隆抗體，37℃，2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替陰性正常組一抗，然后加入辣根酶標記山羊抗鼠IgG多克隆抗體，37℃，30 min，隨后二氨基聯苯胺(DAB)顯色，復染、脫水、透明、中性樹膠封片，在高倍鏡視野(×400)下每張切片隨機選擇10個視野，應用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對神經細胞陽性細胞積分光密度值(IOD)進行測定。

1.7RT-PCR法檢測各組DPN大鼠坐骨神經中HMGB1 mRNA表達 從液氮中取出保存備用的坐骨神經，應用RNA提取試劑盒提取總RNA。參照試劑盒操作說明，將總RNA逆轉錄成cDNA。HMGB1上游序列為5′-GCAGCAGTGTTGTTCCACAT-3′，下游序列為5′-CGGCCTTCTTCTTGTTCTGT-3′，內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游序列為5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。以cDNA 1 μl為模板擴增HMGB1和GAPDH，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達情況。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般情況觀察 干預12 w后，與正常對照組相比，其他各組表現出不同程度的多飲、多食、尿量增多及體重下降。模型對照組毛色污穢發黃、缺少光澤，豎毛弓，背腹部膨隆，活動度減小，精神萎靡不振，后肢單側或雙側偶見痙攣甚至痿廢。各治療組與模型對照組比較病變程度較輕，其中益氣通絡方高劑量組與西藥對照組狀態較好。

2.2益氣通絡方對DPN大鼠體重及FBG的影響 干預12 w后，模型對照組體重較正常對照組顯著降低，FBG顯著升高(P<0.05)；進行藥物干預后，益氣通絡方高、低劑量組與模型對照組比較，體重顯著升高，FBG顯著降低(P<0.05)，其中，益氣通絡方高劑量組體重增長和FBG下降更為顯著(P<0.05)。見表1。

2.3益氣通絡方對DPN大鼠坐骨神經傳導速度的影響 給藥12 w后，與模型對照組相比，各組坐骨神經運動神經傳導速度(MNCV)及感覺神經傳導速度(SNCV)顯著升高(P<0.05)；益氣通絡方高劑量組MNCV、SNCV改善顯著(P<0.05)。說明益氣通絡方可顯著提高DPN大鼠的坐骨神經傳導速度。見表1。

2.4益氣通絡方對DPN大鼠坐骨神經中HMGB1蛋白和mRNA表達的影響 干預12 w后，模型對照組HMGB1蛋白和mRNA表達顯著高于正常對照組(P<0.01)；與模型對照組比較,益氣通絡方高、低劑量組與西藥對照組坐骨神經中的HMGB1蛋白和mRNA表達均顯著降低(均P<0.05)。說明益氣通絡方與西藥效果一致，都能使DPN大鼠坐骨神經內HMGB1蛋白和mRNA含量表達降低，但益氣通絡方高劑量組較低劑量組效果更佳。見表1。

3 討 論

DPN的發病機制至今尚未闡釋清晰。研究發現〔6〕，低水平慢性炎癥反應在DPN發生發展中的作用越來越受到人們的關注。HMGB1作為一種重要的晚期致炎因子，幾乎表達于所有細胞中〔7〕，由單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞等免疫細胞釋放，其功能是介導炎癥反應〔8〕。正常情況下，HMGB1存在于細胞核內，負責參與轉錄和調控基因〔9〕；當機體缺血、缺氧時，HMGB1通過主動分泌或被動釋放兩種方式至胞外，發揮炎性介質的作用〔10〕，指導細胞因子、趨化因子、神經免疫或代謝活動等〔11〕。且HMGB1通過識別晚期糖基化終末產物受體(RAGE)和Toll樣受體(如TLR2、TLR4)，誘導炎癥反應，加速免疫損傷〔12,13〕。此外,HMGB1可調節自噬,增強細胞存活,并限制細胞凋亡〔14〕。HMGB1信號級聯還可能觸發核因子(NF)-κB途徑，進一步激發炎癥反應，增加組織損傷。因此，進一步探索HMGB1相關信號通路可能為DPN的治療提供新的靶點。

益氣通絡方是張文風教授多年臨床治療糖尿病周圍神經病變的經驗方，具有益氣養陰，活血通絡的功效，臨床效果顯著。方中芪葛同用為君，益氣養陰，祛瘀通絡；桂枝辛散溫通，配伍黃芪，益氣溫陽，活血通經；生地清熱養陰生津，俱為臣藥。當歸補血活血，與生地相配，養血活血，祛瘀不傷陰，此為佐藥。地龍善走力專，通經活絡，并引藥入絡，為佐使藥?，F代藥理學研究發現，黃芪、葛根有效成分都有降血糖、抗炎及保護神經作用〔15〕，黃芪、葛根配伍能夠減輕機體的糖脂代謝紊亂和炎癥反應，且增加機體對胰島素的敏感性〔16,17〕。生地具有抗炎、改善血糖及促進血管內皮細胞增殖的作用，環烯醚萜苷是生地的有效成分，對晚期糖基化終末產物(AGEs)引起的糖尿病血管病變具有明顯的抑制作用〔18〕。研究證實，當歸能對缺氧所致的神經損傷進行保護；并促進血管內皮生長因子激活和神經再生〔19〕；桂枝揮發油具有抑制炎癥反應及抗氧化作用，能顯著拮抗免疫損傷性炎癥〔20〕；地龍中蚓激酶可通過改善血液循環從而減少糖尿病患者周圍神經的缺血缺氧性損傷,有效地促進神經修復、再生〔21〕。諸藥合用，可發揮改善神經細胞功能、營養周圍神經作用，有效改善DPN的神經損傷。

本研究提示益氣通絡方可以有效降低DPN大鼠FBG，增加體重，改善坐骨神經炎癥損傷；可有效下調坐骨神經HMGB1蛋白和mRNA水平，HMGB1可能參與DPN的發病過程，抑制炎癥反應，保護坐骨神經免收損傷，對DPN具有很好的治療效果。