從健康人尿液篩選年齡相關蛋白質

鄭舒心，趙敏迪，邵 晨，孫海丹，劉曉燕，郭正光，孫 偉*

(1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 藥理系，北京 100005；2.北京醫院 國家老年醫學中心 檢驗醫學科，北京 100730； 3.國家蛋白質科學中心(北京) 北京蛋白質組研究中心 北京生命組學研究所，北京 102206)

近年來，尿液逐漸成為尋找疾病標志物的重要來源[1]。但是，尿液生物標志物發現的主要瓶頸之一是尿液蛋白的濃度和組成受到許多因素的影響，包括年齡、性別、飲食等[2]。因此，健康人尿蛋白質組的個體差異分析可以排除疾病標志物發現過程中個體差異的影響，為蛋白質組學研究提供背景，具有重要的臨床價值[3]。

目前已有報道健康成人尿液中的個體差異蛋白，但以往分析多數是研究性別相關差異蛋白，且年齡相關差異蛋白研究深度不足[3-4]。本研究對正常人尿液進行蛋白質組分析，試圖發現與年齡相關的尿蛋白，為后續的年齡相關蛋白質組學及疾病標志物研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象:尿液樣本來自中國人民解放軍總醫院第一醫學中心。受試者為29名20～69歲的健康成年人。所有受試者都沒有急性或慢性疾病，在收集尿液時也沒有服用任何藥物。受試者年齡分組信息表1。所有受試者均簽署了知情同意書，本研究得到了中國醫學科學院基礎醫學研究所倫理委員會的批準(倫理審批號：047-2019)。

表1 受試者年齡分組Table 1 Groups based on age of urine donors

1.1.2 試劑:二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAM)、尿素、硫脲(Sigma-Aldrich 公司)；胰蛋白酶(質譜級)(Promega公司)；乙腈、甲酸、乙醇、碳酸氫銨均為色譜級(Merk公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白提取及酶切：尿液樣本5 000×g/min 離心 30 min，去掉尿沉渣。上清液用 3 倍體積的乙醇在 4 ℃ 冰箱過夜后 10 000×g/min 離心 30 min 得到尿蛋白沉淀。沉淀用裂解液溶解[7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 0.1 mol/L二硫蘇糖醇和50 mmol/L三氨基甲烷(Tris)]，37 ℃ 靜置 1 h，加入 1 mol/L 的碘乙酰胺至終濃度 0.05 mol/L，室溫避光 45 min。樣本轉移到 10 ku 超濾膜上用緩沖液 (7 mol/L 尿素和 50 mmol/L Tris)清洗兩次之后，用 25 mmol/L 碳酸氫銨溶液再清洗兩次。處理后的樣品在 25 mmol/L碳酸氫銨溶液中用胰蛋白酶消化。消化后的肽段從10 ku的過濾器中洗脫，在C18柱上脫鹽。

1.2.2 肽段預分離：29 個樣本及混合的質控樣本肽段首先用高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，3 μm) 進行預分離，多肽的洗脫液梯度為 5%～35% B 液(90% 乙腈)，流速為1 mL/min，洗脫時間為30 min。每分鐘收集一個組分，抽干后溶解于 0.1%甲酸水溶液，按照6～7、 8～9、 10～11、 12～13、 14～16、17～19、 20～22和 23～26 將收集的組分合并為 8 個組分。

1.2.3 質譜分析：上述樣品的各個組分均采用相同的 LC-MS/MS 參數進行分析。多肽樣品采用毛細管色譜柱(75 mm×100 mm) 進行分離，多肽的洗脫液梯度為 5%～30% B 液(0.1% 甲酸，99.9%乙腈)，流速為300 nL/min，洗脫時間為 40 min。洗脫的肽段用TripleTOF 5600質譜儀分析鑒定，分析模式采用數據依賴采集模式，參數如下: 一級全掃描分辨率為 40 000；二級掃描分辨率為20 000; 電荷篩選范圍(+2～+4); 二級全掃描范圍為100 m/z～1 800 m/z，動態排除時間為15 s，掃描時間為100 ms。本實驗總計共進行了272 次LC-MS/MS質譜分析，包括29個樣品的232次分析以及5次技術重復Q 樣品的40次分析。

1.3 統計學分析

1.3.1 定性分析:質譜數據應用 Mascot (Matrix Science 公司，2.5.01版本)軟件進行數據庫檢索，數據庫為 SwissProt 人類蛋白質組學數據庫(www.uniprot.org, 20 121 條序列)。搜索參數為: 胰蛋白酶酶切，誤切位點為 2 個，母離子和子離子的質量精確度為 5 ppm，固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化，可變修飾為甲硫氨酸氧化(+43.00 ku)。獲得的數據庫搜索結果由Scaffold進一步處理(版本 4.0.7)蛋白水平的假陽性率為小于1%。

1.3.2 非標記定量分析:應用 Progenesis LC-MS軟件(版本 4.0)，將其電荷數篩選為 +2 到 +5 對蛋白質進行鑒定和定量分析。P<0.05且變化倍數大于 2 或小于 0.5 的蛋白為差異蛋白。

1.3.3 生物信息學分析:用 SIMCA 軟件(版本 14.1)對蛋白進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，用 IPA (Ingenuity Pathway Analysis)軟件對差異蛋白進行通路富集分析。

2 結果

2.1 尿液蛋白質組的分析及年齡相關蛋白的篩選

在14名健康男性的尿液樣本中定量到1 683個蛋白質，在15名健康女性的尿液樣本中定量到1 679個蛋白質。通過計算5個QC重復中蛋白質豐度的差異系數(CV)來評估該分析的技術差異，技術差異系數CV中位數為0.24。男性組與女性組中每種蛋白質的生物差異分別用14名男性和15名女性尿樣中所測蛋白質豐度來評估，男性組生物差異系數CV中位數為0.54，女性組生物差異系數CV中位數為0.55，都顯著高于技術變異系數中位數(0.24)。將兩組定量到的蛋白質分別做PCA分析，結果表明男性組和女性組各自3個年齡段組之間的尿蛋白質組表現出明顯的分離趨勢(圖1)。

對男性和女性組分別進行年齡相關蛋白分析。根據P<0.05且蛋白表達顯著性差異倍數大于2倍為標準篩選差異蛋白(圖2)。男性組和女性組與年齡相關的差異蛋白質分別有100個和94個，共同的蛋白有12個，其中11個為上調蛋白，1個為下調蛋白(表2)。

2.2 年齡相關蛋白的生物信息學分析

男性組中上調的通路功能主要集中在維生素代謝、糖代謝及凝血系統；下調蛋白代謝通路功能主要集中在免疫系統、疾病以及肌醇磷酸代謝。女性組中上調蛋白的通路功能主要集中在維生素代謝、氨基酸代謝以及脂質代謝；下調蛋白的通路功能主要集中在免疫系統以及疾病(圖3)。

3 討論

健康人尿液蛋白質組的研究可以為疾病的診斷和監測提供基礎。有研究表明隨著年齡的增長會導致許多疾病的發生，如心血管疾病[5]、關節炎[6]及癌[7]等。因此更深入的了解隨年齡增長相關蛋白質組學的變化有助于衰老疾病機制的研究，并促進新的抗衰老療法等研究的發展。

隨著年齡的增長，蛋白質生物合成普遍減緩，與物質營養代謝相關的許多酶的表達量降低，導致參與碳水化合物代謝、維生素代謝、能量代謝等過程中的化合物的生成明顯減少[8]。無論男性組或女性組中在青年組均發生上調的一個重要蛋白是亞甲基四氫葉酸脫氫酶 1 (C-1-tetrahydrofolate synthase，MTHFD1)，它是一種葉酸代謝途徑中的關鍵酶，是合成胸苷酸、嘌呤核苷酸和蛋氨酸的底物[9]。本研究中MTHFD1參與的代謝通路主要有葉酸多聚谷氨酸、組氨酸降解III及葉酸轉化I，說明隨年齡增長會發生氨基酸及葉酸代謝程度的降低。有實驗表明MTHFD1在腎腫瘤組織中的表達明顯低于健康人腎組織，同時MTHFD1表達增高的患者5年生存率明顯提高。這些結果證實了MTHFD 1對腎癌細胞的抗腫瘤作用[10]。年齡增長過程中MTHFD 1的表達量降低也許會導致細胞凋亡減少和癌細胞增值加快而導致癌癥等疾病的發生，但具體機制有待進一步研究。

圖1 男性組女性組PCA分析Fig 1 PCA analysis of male and female groups

圖2 男性組和女性組差異尿蛋白火山圖分析Fig 2 Volcano analysis of differential proteins of male group (A, B) and female group (C, D)

表2 男性組和女性組共同的12個差異尿蛋白Table 2 Twelve differential urine proteins overlapped in male and female groups

圖3 男性組女性組差異表達蛋白代謝通路分析Fig 3 Pathway analysis of differential proteins of male group (A) and female group (B)

總之，本實驗對男性女性不同年齡段健康成年人尿液應用蛋白質組學的方法來分析年齡相關的蛋白組特征。分析結果揭示了高齡人群與低齡人群的尿液蛋白質組差別，這表明利用尿液蛋白質組可以反映年齡相關的變化，有可能利用尿液發現年齡相關標志物，并進行年齡狀態的評估。