piRNAs在阿爾茨海默病患者腦中的差異表達

孫添怡，劉 帆，仇文穎，馬 超

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 人體解剖與組織胚胎學系，北京 100005)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種神經退行性疾病，起病隱匿，進展緩慢，患病率正逐年上升，目前缺乏有效的治療手段[1-2]。piRNA(PIWI-Interacting RNA)是一種發現僅10余年的非編碼小RNA，長度為24～32個核苷酸[3]。最初在小鼠和大鼠的生殖細胞中鑒定出piRNA與PIWI蛋白相互作用形成一種RNA誘導沉默復合物，在沉默轉座過程、調節基因表達等方面發揮生物學功能[4-5]。研究發現piRNA在中樞神經系統中可能影響AD的核心病理生理過程，在β-淀粉樣蛋白-42(amyloid β-protein 42, Aβ42)的異常生成、tau的分裂和翻譯后標記、Aβ42和tau的清除受損等方面發揮作用[6]?；谇捌谘芯砍晒?，本實驗選取經預測與AD相關性高的10個在人腦中表達的piRNA[7]，比較AD組和對照組中這些piRNA及其相關mRNA的表達差異，從而探索與AD相關的piRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腦組織樣本:本實驗所用的人腦組織都來自中國醫學科學院北京協和醫學院的國家發育和功能人腦組織資源庫(National Human Brain Bank For Development and Functions)。所有大腦樣本均根據中國人腦組織庫協作聯盟2019年發布的中國人腦庫標準化操作規程采集[8]。所有捐獻者均已簽署知情同意書。本研究由中國醫學科學院基礎醫學研究所倫理委員會批準(批準文號：009-2014)。

1.1.2 試劑：Agilent RNA 6000 Kit(Agilent)，snRNA cDNA Kit、snRNA PCR Kit、mRNA cDNA Kit、mRNA PCR Kit(北京康為世紀生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦組織病理染色及評分和分組：按照NIH-AA發布的AD神經病理評估指南推薦的染色及評分方法[9]，對腦組織石蠟切片進行ABC病理染色并評分，ABC病理染色包括Aβ染色、p-tau染色和Garvey銀染染色。根據Aβ斑塊、神經纖維纏結、神經炎性斑塊分布及數量對19例人腦進行AD的ABC評分:“無(None，N)”“低(Low，L)”“中(Immediately，IM)”“高(High，H)”。染色后將樣本分為兩組，AD組10例，對照組9例。

1.2.2 Real-time PCR檢測piRNA及相關mRNA：取冰凍保存的前額葉組織約200 mg加入1 mL Trizol試劑，研磨成勻漿后加入0.2 mL氯仿劇烈振蕩，靜置后12 000 r/min離心15 min，取上清加入0.5 mL異丙醇，12 000 r/min離心10 min后棄上清，向沉淀中加入1 mL 75%乙醇輕輕混勻，750 r/min離心5 min后棄上清，晾干RNA樣本后加入適量無核酸酶水溶解得到RNA溶液。

根據Agilent RNA 6000合成試劑盒說明書組裝芯片，將65 μL的膠和1 μL的染料混合，避光室溫13 000 r/min離心10 min，將混合物按說明書吹入RNA芯片標記G的孔，RNA樣品1 μL吹入樣品孔中，DNA分子質量標準1 μL吹入ladder孔中。振蕩后將芯片放入Agilent 2100生物分析儀中檢測腦組織樣本RNA完整性(RNA integrity number，RIN)。檢測后得到合格樣本13例，AD組6例，對照組7例進行后續實驗。

根據snRNA cDNA試劑盒說明書把從人腦組織中提取的非編碼小RNA加poly(A)尾，反轉錄合成cDNA。根據snRNA RT-qPCR試劑盒說明書進行real-time PCR(RT-qPCR)反應，反應體系：2×qPCR Mixture 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、piRNA cDNA 3 μL、無核酸酶水稀釋到20 μL。Biorad CFX96熒光定量PCR儀進行RT-qPCR反應，過程如下：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，變性、退火、延伸40個循環后停止反應。

根據mRNA cDNA試劑盒說明書把從人腦組織中提取的RNA反轉錄合成cDNA。根據mRNA RT-qPCR試劑盒說明書進行RT-qPCR反應，反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)12 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、 下游引物(10 μmol/L)1 μL、 cDNA 2 μL、無核酸酶水稀釋到25 μL。Biorad CFX96熒光定量PCR儀進行RT-qPCR反應，過程如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸30 s，共進行30個循環后停止反應。引物序列見表1。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 人腦樣本的篩選及RNA質量評價

經AD病理評分，染色例圖(圖1)，評分結果及樣本背景信息(表2)。

19例腦樣本RNA濃度區間范圍是245～1 080 mg/L，A260/280區間范圍是1.83～2.28，RIN值區間范圍是2.8～7.7(表3)。將RIN ≥6.0視為合格樣本，其中13例腦組織標本合格，含AD組6例，對照組7例。瓊脂糖凝膠電泳中13例合格樣本RNA顯示了清晰的條帶(圖2A，B)，6例不合格樣本條帶不清晰(圖2A，C)。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

A.the arrow pointing at amyloid β deposits; B.the arrow pointing at neurofibrillary tangles; C.the arrow pointing at neuritic plaques; A-C.AD group; D-F.aging control group; A&D.Aβ staining; B&E.P-tau staining; C&F.garvey staining

表2 AD組及對照組詳細樣本信息

表3 AD及對照組RIN值檢測結果

A.agarose gel electrophoresis detection, number 1 to 13 represented qualified samples, a to f represented unqualified samples(n=19); B.Kurtosis curve of RIN value of qualified sample; C.Kurtosis curve of RIN value of unqualified sample

2.2 piRNA在AD患者和對照人群腦組織中表達

選取的10個piRNA 均出現AD組表達量降低的趨勢(表4)，其中4個piRNA DQ597973、DQ576872、DQ597479和DQ600318在AD組表達量顯著降低(P<0.05)(圖3)。

2.3 DQ600318相關的mRNA LRRC37A3在AD患者和對照人群腦組織中表達

LRRC37A3在AD組為0.76±0.12，較對照組的1.47±0.42顯著降低(P<0.01)(圖4)。

表4 AD及對照組RT-qPCR檢測結果

3 討論

piRNA在人腦中含量豐富，可能是導致AD的危險因素之一，在小樣本的篩選中已經發現其不可忽視的潛在作用[10]。本文對10個piRNA進行檢測，均表現為AD組表達量降低，提示piRNA表達量降低可能與AD相關。其中有3個piRNA出現的變化趨勢與參考文獻相同，其余相反，產生原因可能是二者檢測方法不同，文獻中采用測序法而本文選擇RT-qPCR法，并且人腦的個體差異較大，不同樣本間差異明顯，在增大樣本量后可能得出可信度更高的結果。

大腦中piRNA的生物發生模式為核定位[11]，位于基因內或來自基因間區域的piRNA可能調節鄰近基因的mRNA穩定性和翻譯[12]。研究確定的AD相關piRNA中，41%富集在蛋白質編碼基因，表明這些piRNA序列是對蛋白質編碼基因的補充或接近[7]，這些piRNA極可能通過序列互補性來靶向調節鄰近的基因[13]。其中DQ600318位于17號染色體60、325、632-60、325、657，LRRC37A3位于17號染色體62、850、486-62、914、903，二者在染色體上位置接近，推測LRRC37A3表達可能受DQ600318表達的調控。

DQ600318與LRRC37A3分別在TOMM40-rs2075650以及ApoE-rs4420638兩個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNP)出現明顯差異[7]。歐洲人腦TOMM40-rs2075650可能增加AD的發病風險[14]，而ApoEε 4又是公認的癡呆最大風險因子[15]。因此推測DQ600318和LRRC37A3可能是AD相關風險基因，對DQ600318的檢測或許會是AD新的檢測標記。

Independent sample t test, *P<0.05, **P<0.01compared with control group;AD group (n=6)； control group (n=7); A.DQ600318(P<0.01); B.DQ597479; C.DQ597973; D.DQ576872

AD group (n=6); control group (n=7); A.DQ581610; B.DQ590835; C.DQ571669; D.DQ586404; E.DQ586113; F.DQ571030圖4 無差異的6個piRNA在AD及對照組表達Fig 4 No significant differential expression was shown in 6 piRNAs compared with control