基于CRISPR/Cas9介導的同源重組技術構建TK、gE和gI基因缺失的偽狂犬病病毒

張華偉，周明光，侯真真，朱嫻靜，郝根喜，金建云，徐高原

武漢科前生物股份有限公司研發中心，武漢 430200

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，其主要特征為患病動物體溫升高、打噴嚏、呼吸困難和神經系統障礙[1]。豬是PRV的天然宿主和主要傳染源。PRV可引起妊娠母豬流產、死胎，公豬不育，仔豬死亡，育肥豬呼吸困難、生長停滯等，養殖場一旦暴發偽狂犬病，就會造成巨大的經濟損失。

目前，防制和凈化PR的主要策略仍是接種疫苗。滅活疫苗和傳統減毒活疫苗對早期PR的防控起到了一定的積極作用，尤其是Bartha-K61株弱毒疫苗，在2011年前對我國PR的防控起到了關鍵性作用。但滅活疫苗存在接種劑量大、免疫期短和免疫途徑單一等缺點；傳統弱毒活疫苗存在毒力返強、運輸和保存條件受限等缺點。為此，研究人員進行了基因工程疫苗的研制，例如基因缺失弱毒疫苗、亞單位疫苗、嵌合疫苗，其中基因缺失弱毒疫苗相對成熟，我國研究人員已成功研制了一批具有自主知識產權的、技術先進并且效果良好的基因缺失弱毒疫苗[2-4]。

基因缺失弱毒疫苗主要是通過分子生物學的手段，對PRV基因組中毒力基因的若干堿基進行刪除，使基因徹底失活。以往研制基因缺失弱毒疫苗主要是采用同源重組的方法，重組效率非常低，后期也需要花費大量的時間進行純化。CRISPR/Cas9技術是最近幾年在研究領域中極其熱門的技術[5]，被廣泛應用于病毒編輯、疫苗研制等方面。2016年，Tang等[6]利用CRISPR/Cas9技術成功構建了TK、gE和gI基因缺失的偽狂犬病病毒。CRISPR/Cas9雖然具有同時敲除多個基因，或者多個sgRNA靶向一個基因的優勢，但是仍存在脫靶、精準修復率低以及后期需要在蛋白水平上多次驗證的問題。DNA雙鏈斷裂后，通常以2種方式進行修復：非同源末端連接和同源介導的雙鏈DNA修復[7]。CRISPR/Cas9系統導致的雙鏈斷裂通常以非同源末端連接的方式進行修復，通過同源介導的雙鏈DNA修復方式修復的比例不足10%[8-9]。因此，很難按照研究者的意愿進行精確地定點編輯。CRISPR/Cas9介導的同源重組技術是以CRISPR/Cas9為媒介將DNA雙鏈斷裂開，然后使用同源重組的方法，將轉入細胞的序列補在缺口上，從而完成基因組的編輯[10]。該技術使用轉移質粒將同源序列轉入到細胞中，可提高同源介導的雙鏈DNA修復的比例，彌補CRISPR/Cas9技術精確修復率低和同源重組技術重組效率低等問題，大幅提高基因編輯的效率，縮短疫苗的研發周期，使疫苗更好地預防當前流行毒株，達到更佳的免疫效果。

2011年，豬的偽狂犬病在我國再度流行，很多免疫Bartha-K61株偽狂犬病弱毒疫苗的豬場也出現了疫情，并且表現出典型的偽狂犬病臨床癥狀，研究表明出現了新的、致病力更強的偽狂犬病病毒變異毒株[11]。因此有必要以當前流行的PRV變異毒株為基礎，研制新的偽狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pX335質粒、pBluescript II-SK(+)質粒、pcDNA3.1(+)質粒購自Addgene公司；限制性內切酶、pMD18-T載體購自TaKaRa公司；FastDigest Bpil購自Thermo scientific公司；T4 PNK購自NEB(北京)有限公司；膠回收試劑盒和DNA提取試劑盒購自天根公司；質粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；病毒核酸DNA/RNA提取試劑盒(柱提法)由武漢科前生物股份有限公司提供；脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司；DNA抽提液購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；PRV gB和gD單克隆抗體由武漢科前生物股份有限公司研發中心制備；Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清(FBS)、DMEM購自Gibco公司；PRV HB2017株由武漢科前生物股份有限公司研發中心在湖北某豬場的病料中分離所得；豬腎細胞(PK-15)、豬睪丸細胞(ST細胞)購自美國標準菌種收藏中心；21日齡的偽狂犬病病毒陰性仔豬購于湖北武漢某豬場。

1.2 病毒基因組提取

提前24 h將PK-15細胞傳代于T25細胞培養瓶中，然后將病毒以1 MOI(multiplicity of infection,MOI)感染劑量接種于細胞，待細胞出現80%病變時，棄去細胞培養液，加1 mL的細胞裂解液，均勻晃動使所有細胞裂解，冰中放置20 min，傾倒至2 mL EP管中。逐滴加入660 μL的5 mol/L NaCl，輕輕混勻后，置于冰上5 h或置于4 ℃冰箱過夜。4 ℃ 12 000 r/min離心30 min。用剪去尖端的槍頭吸取上清于新的2 mL EP管中，加入等體積的DNA抽提液，輕輕上下顛倒EP管5 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，重復利用DNA抽提液抽提蛋白3次。換1.5 mL的EP管，最后的上清液加入預冷的2倍體積的無水乙醇，輕柔混勻，-20 ℃靜置2 h或過夜。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀加入預冷的75%的無水乙醇，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min洗滌2遍。棄上清，4 ℃ 12 000 r/min離心1 min，吸取殘余液體，風干后加入15 μL的去離子水溶解基因組，4 ℃保存備用。

1.3 CRISPR/Cas9 sgRNA質粒的構建

將病毒基因組序列輸入sgRNA在線設計網站(http://crispr.mit.edu)，尋找有PAM(NGG)的sgRNA序列，選擇脫靶率最低的sgRNA，將其克隆至pX335載體[12]，sgRNA序列如表1所示。

表1 用于靶向病毒相關基因的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences for targeting virus-related genes

1.4 轉移質粒pcDNA3.1-ΔTK和pSK-ΔgIΔgE的構建

以PRV HB2017株基因組為模板擴增TK和gI/gE基因部分序列，然后將其連接到pMD18-T載體上，隨后依次酶切連接到pcDNA3.1(+)或pBluescript Ⅱ-SK(+)載體上，用以構建轉移質粒pcDNA3.1-ΔTK和pSK-ΔgIΔgE。其中，TK左右同源序列間插入猴空泡病毒40(sv40)poly A序列；擴增引物序列如表2所示。

表2 與轉移質粒構建相關的引物序列Table 2 Primer sequences related to transfer plasmid construction

1.5 重組病毒的構建

PK-15細胞傳代于6孔細胞板中，細胞匯合度達80%～90%時進行轉染。將2 μg同源臂轉移質粒、2 μg sgRNA和病毒基因組(約2 μg)加入到150 μL Opti-MEM中，輕輕混勻，與此同時，將12 μL LiP2000 DNA轉染試劑加入到150 μL Opti-MEM中，輕輕混勻，5 min內將轉染試劑混合液加入到質?；旌弦?，輕輕混勻，室溫孵育20 min，在此期間，將待轉染的細胞用不含血清的DMEM洗滌2次，加1.7 mL不含血清的DMEM，隨后，將轉染復合物均勻地滴加到6孔細胞板中。轉染12 h后更換成含5% FBS的DMEM，將培養板繼續放于37 ℃細胞培養箱中培養48～96 h。

1.6 重組病毒的PCR鑒定

利用病毒核酸DNA/RNA提取試劑盒提取重組病毒的基因組，根據病毒基因缺失位置，利用Primer 5.0軟件設計引物，然后以重組病毒的基因組為模板進行PCR擴增，核酸電泳及測序后進行比較與鑒定，引物序列如表3所示。

表3 重組病毒鑒定引物Table 3 Recombinant virus identification primers

1.7 重組病毒的間接免疫熒光鑒定

將ST細胞接種于96孔細胞板中，分為3組，每組10個孔，待細胞長滿單層后，其中1組接種重組病毒PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株(MOI=0.01)，另外1組接種親本毒株PRV HB2017株(MOI=0.01)，第3組加入DMEM作為對照組(Mock)。待80%的細胞出現病變時，棄去培養基，PBS洗滌3遍后，丙酮4 ℃固定30 min，2% BSA 37 ℃封閉1 h，然后用PBS洗滌3遍。隨后3組細胞中的5個孔加入100 μL gB單克隆抗體(1∶500稀釋)，另外5個孔加入100 μL gE單克隆抗體(1∶500稀釋)，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3遍后，加入50 μL羊抗鼠IgG(1∶300稀釋)，37 ℃孵育45 min；PBS洗滌3遍后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 重組病毒遺傳穩定性測定

重組病毒PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株在PK-15細胞上連續傳代，選取第5、10、15、20、25和30代病毒，使用引物gE/gI_ide-F/R和TK_ide-F/R對缺失基因的部分序列進行PCR擴增，并將PCR產物送至武漢擎科生物公司測序。

1.9 重組病毒一步生長曲線繪制

將PK-15細胞以2×105個/孔傳代于24孔細胞板中，待細胞貼壁后將病毒以0.1 MOI的感染劑量接種細胞，吸附2 h后換成含2% FBS的培養基繼續培養。自接種時起，每隔6 h收集1次，將細胞培養板置于-80 ℃冰箱凍融3次后收獲病毒。采用蝕斑實驗和Reed-Muench法在ST細胞上測定并計算其TCID50[13]，繪制一步生長曲線。

1.10 重組病毒安全性試驗

選取21日齡的偽狂犬病病毒陰性仔豬(gB抗體和gE抗體均為陰性)15頭；隨機分為3組，每組5頭，其中1組的仔豬滴鼻接種PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株(107.0TCID50/頭)，另1組的仔豬滴鼻接種PRV HB2017株(107.0TCID50/頭)，第3組滴鼻接種1 mL的DMEM作為對照組。接種后觀察21 d，每天測量體溫，觀察和記錄臨床癥狀。

1.11 重組病毒對仔豬的免疫保護力試驗

選取21日齡的偽狂犬病病毒陰性仔豬20頭(gB抗體和gE抗體均為陰性)，隨機分為4組，每組5頭，隔離飼養。2個免疫組分別肌注PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株1.0×106.0TCID50/頭份或1.0×107.0TCID50/頭份，另2組注射1 mL DMEM，作為攻毒對照組和自然對照組。免疫后第28天，使用PRV HB2017株對2個免疫組和攻毒對照組進行滴鼻攻毒，攻毒劑量為1.0×108.0TCID50/頭，空白對照組滴鼻1 mL的DMEM，攻毒后觀察21 d，每天觀察2次，測量體溫，記錄癥狀。

2 結果與分析

2.1 PRV基因缺失病毒HB2017ΔTK株的構建與鑒定

將PRV HB2017基因組、含TK同源臂的轉移質粒pcDNA3.1-ΔTK和sgRNA sg-TK共轉染到PK-15細胞中，隨后利用PK-15細胞進行蝕斑純化。經過3輪蝕斑純化后，利用鑒定引物TK_ide對重組病毒進行PCR鑒定，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后結果顯示，HB2017親本毒株擴增產物大小為433 bp，HB2017ΔTK毒株和pcDNA3.1-ΔTK質粒擴增產物大小一致，為583 bp(圖1A)，表明獲得了HB2017ΔTK株。

A和B分別為重組病毒TK、gE/gI基因的鑒定結果，A和B的M泳道分別為DL2 000和DL5 000；1為轉移質粒；2為親本毒株HB2017；3為重組病毒；4為陰性對照。A and B are the identification results of TK and gE/gI genes of recombinant viruses,respectively,and the M lanes of A and B are DL2 000 and DL5 000,respectively.1 is transfer plasmid,2 is the parent strain HB2017,3 is the recombinant virus,and 4 is the negative control.圖1 PCR鑒定重組病毒Fig.1 Identification of recombinant viruses by PCR

2.2 PRV基因缺失病毒HB2017ΔTKΔgE/I株的構建與鑒定

將重組毒PRV HB2017ΔTK株基因組、含gE/gI同源臂的轉移質粒pSK-ΔgE/gI和sgRNA sg-gE/I-1和sg-gE/I-2共轉染到PK-15細胞中，隨后利用PK-15細胞進行蝕斑純化。經過3輪蝕斑純化后，利用鑒定引物gE/gI_ide對重組病毒進行PCR鑒定，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后結果顯示，HB2017親本毒株擴增產物大小為2 971 bp，HB2017ΔTKΔgE/gI毒株和pSK-ΔgE/gI質粒擴增產物大小一致，為663 bp(圖1B)。

將重組病毒HB2017ΔTKΔgE/gI和親本毒株HB2017接種ST細胞，隨后利用PRV gB和gE的單克隆抗體進行間接免疫熒光實驗。結果發現，用gB單克隆抗體孵育后，接種重組病毒HB2017ΔTKΔgE/gI和親本毒株HB2017的細胞均可觀察到綠色熒光，然而用gE單克隆抗體孵育后，只有接種親本毒株HB2017的細胞可觀察到綠色熒光(圖2)，表明重組病毒中gE基因已有效缺失。以上結果表明，獲得了TK、gE和gI基因缺失的PRV基因缺失毒株PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株。

圖2 間接免疫熒光鑒定重組病毒Fig.2 Identification of recombinant viruses by indirect immunofluorescence

2.3 重組病毒遺傳穩定性測定

為了檢測PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株的遺傳穩定性，進行了細胞連續傳代試驗，將該毒株在PK-15細胞上連續培養30代，每隔5代進行PCR擴增和測序，結果顯示PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株在TK(圖3A)和gE/gI(圖3B)基因缺失部分非常穩定，不能恢復。

A和B分別為重組病毒TK、gE/gI基因的鑒定結果，A和B的M泳道分別為DL2000和DL5000；1為PRV HB2017；2～7為重組病毒在PK-15中傳代至5、10、15、20、25和30代，收獲的病毒；8為陰性對照。A and B are the identification results of TK and gE/gI genes of recombinant viruses respectively,and the M lanes of A and B are DL2000 and DL5000 respectively.1 is PRV HB2017,2-7 are the virus harvested after the recombinant virus passed to 5,10,15,20,25 and 30 generations in PK-15,and 8 is the negative control.圖3 重組病毒在PK-15中的遺傳穩定性Fig.3 Genetic stability of recombinant viruses in PK-15

2.4 PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株一步生長曲線繪制

通過對重組病毒PRV HB2017ΔTKΔgE/gI和其親本毒PRV HB2017進行生長曲線的測定，發現PRV HB2017ΔTKΔgE/gI在6～30 h的病毒滴度略低于其親本毒PRV HB2017，隨后在36～48 h兩者無明顯差別且進入平臺期(圖4)。

圖4 PRV HB2017ΔTKΔgE/gI和HB2017在PK-15細胞中的生長曲線圖Fig.4 Growth curves of PRV HB2017ΔTKΔgE/gI and HB2017 in PK-15 cells

2.5 PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株對仔豬的安全性試驗

PRV HB2017ΔTKΔgE/gI接種仔豬后，仔豬未表現出體溫升高、打噴嚏、厭食、顫抖、共濟失調等發病癥狀，而PRV HB2017接種仔豬后則出現持續高熱、打噴嚏、死亡，表明缺失gI、gE、TK基因后的PRV HB2017ΔTKΔgE/gI已充分致弱，對仔豬是安全的。

表4 重組病毒對仔豬的安全性試驗結果Table 4 Safety test results of recombinant virus in piglets

2.6 PRV HB2017ΔTKΔgE/gI對仔豬的免疫保護力

免疫組在試驗第1天接種PRV HB2017ΔTKΔgE/gI后未出現發病癥狀，在第28天接種PRV HB2017后也未出現發病癥狀；攻毒對照組在試驗第28天接種 PRV HB2017后第3天出現厭食、高熱、打噴嚏或神經癥狀，并在攻毒后第7天出現死亡；空白對照組在試驗中未表現出發病癥狀，仔豬發病情況見表5。表明PRV HB2017ΔTKΔgE/gI對仔豬具有良好的保護能力。

表5 重組病毒對仔豬免疫保護力的試驗結果Table 5 Test results of immune protection of piglets with recombinant virus

3 討 論

2011年，很多免疫Bartha-K61株偽狂犬病弱毒疫苗的豬場出現了偽狂犬病疫情，提示以PRV最新流行毒株構建疫苗毒株的必要性。疫苗引起的免疫反應屬于特異性免疫反應，不同毒株間的交叉反應存在差異，以新的國內流行毒株為親本毒株可以產生更好的免疫效果。本研究采用的2017年在湖北某豬場分離得到的變異毒株HB2017株與國內流行毒株尤其是與2011年之后的流行毒株處于同一個進化分支，而與包括Bartha-K61株在內的歐美毒株處于不同的進化分支，以變異毒株HB2017株為親本毒株制備偽狂犬基因缺失弱毒株可更好地應用于國內偽狂犬病的防控與凈化。

TK和gE基因是PRV的主要毒力基因，TK基因的缺失對毒力的影響較為顯著[14]，TK是構建基因缺失活疫苗的重要候選基因；gE基因與PRV的神經嗜性和PRV在細胞間的擴散相關，gE基因的缺失會減少PRV在三叉神經和交感神經元中的感染；gI在PRV侵入過程中，能夠促進病毒在神經系統中的復制，對病毒的神經嗜性有很大的影響[15]。

本研究以當前流行的偽狂犬病病毒變異毒株HB2017株為親本株，采用CRISPR/Cas9介導的同源重組技術對毒株的毒力基因TK、gE和gI進行敲除，高效快速地構建了缺失弱毒株PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株。之后，對其特性進行了初步研究，顯示PRV HB2017ΔTKΔgE/gI株的細胞增殖曲線與親本株相似，而且具有遺傳穩定、安全性高和免疫原性好等優點，該基因缺失株的構建將為偽狂犬病疫苗的研制提供優良的候選毒株，并為PR疫苗的高效研制提供參考。