516例無精癥Y染色體微缺失及細胞遺傳學分析

吳麗華 胡晶晶 梁凱玲 張憶聰

(廣東省婦幼保健院 醫學遺傳中心，廣東 廣州 511442)

全世界大約有10%～15%的育齡夫婦不育，世界衛生組織認為不育夫婦中的50%都由男性因素引起的[1]，而在男性不育中無精癥和隱匿性無精癥占10%～20%。引起男性無精癥的原因有遺傳學異常、性激素水平異常、免疫異常、年齡和環境等因素。染色體異常及Y染色體微缺失是男性不育癥患者重要的遺傳學病因，也是目前臨床上最關注的遺傳學異常。該病因學檢查有助于臨床采取相應治療措施或輔助生育技術，減少患者經濟負擔。本文通過回顧性分析了516例無精癥的患者的染色體核型和Y染色體上的無精因子(azoospermia factor，AZF)微缺失檢測結果，探討Y染色體微缺失和細胞遺傳學分析在無精癥中發生的頻率以及它們之間的相關性，幫助明確無精癥患者的遺傳學病因。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集自2015年3月至2019年12月近5年來廣東省婦幼保健院生殖健康與不育癥科診斷為無精癥的患者共516例，年齡21～52歲，平均年齡31.7歲。所有的患者均通過體檢和精液常規分析檢查，排除精索靜脈曲張、內分泌紊亂、生殖道炎癥、免疫異常和理化等引起無精的因素。無精子癥的診斷標準按照世界衛生組織第5版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》[2]的定義及方法，檢查精子密度至少3次或3次以上，且精液離心后也未見精子。

1.2 方法

1.2.1 細胞遺傳學分析 患者簽署知情同意后，抽取肝素抗凝外周血4ml，常規進行淋巴細胞培養72h，常規制備染色體，G顯帶，計數20個核型，分析5個核型，有數目異常者加倍計數及分析，染色體命名參考根據《人類細胞遺傳學國際命名體制2016》[3]。

1.2.2 Y染色體微缺失檢測 抽取患者EDTA-K2抗凝外周血2ml，提取基因組DNA，選擇Y染色體AZF上6個STS序列，分別是AZFa:SY84、SY86，AZFb:SY127、SY134，AZFc:SY254、SY255，以SRY(SY14)和ZFAX/Y位點為內對照同時進行擴增，PCR引物末端FAM、JOE和TAMRA熒光基團標記[4]。除ZFX/ZFY引物外，其他引物和擴增條件按照參考歐洲男科學會(European Academy of Andrology，EAA)2004版指導原則和歐洲分子基因診斷質量聯盟(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)標準進行[5]，最后使用GeneMaker(version2.2.0)軟件對毛細管電泳結果進行數據分析。

2 結果

2.1 細胞遺傳學分析 516例無精癥患者中共檢出染色體異?；颊?6例，檢出率12.8%(66/516)。檢出性染色體異常57例(86.36%，57/66)，包括性染色體結構異常4例、性染色體數目異常44例、46,XX性別發育異常4例和嵌合體9例；檢出常染色體結構異常9例(13.64%，9/66)。詳見表1。

2.2 Y染色體微缺失檢測 檢出AZF缺失40例，總缺失率為7.8%(40/516)，包括5例AZFa(12.5%，5/40)、1例AZFb(2.5%，1/40)、20例AZFc(50.0%，20/40)、9例AZFb+AZFc(22.5%，9/40)、4例AZFa+AZFb+AZFc(10.0%，4/40)。詳見表1。

2.3 Y染色體微缺失患者中的細胞遺傳學分析 40例Y染色體微缺失中檢出正常核型27例(67.5%，27/40)，異常核型13例(32.5%，13/40)，異常核型包括46,X,del(Y)(10.0%，4/40)、性染色體嵌合體(12.5%，5/40)和46,XX(10.0%，4/40)。詳見表1。

表1 染色體核型和Y染色體微缺失檢出率及分布

3 討論

在男性無精癥的遺傳病因中，染色體核型異常和Y染色體AZF微缺失是2個常見的遺傳因素。染色體Y染色體長臂q11區存在AZF，其含有3個互不重疊的AZFa、AZFb、AZFc區域組成[6]，為調控精子發生的基因位點，一個或多個區域的缺失可引起生精功能障礙，導致男性無精癥。本研究516例無精癥患者中異常核型檢出率為12.8%，與Fu[7]報道的14.71%相近。我們發現無精癥患者中最常見的異常核型是47,XXY，占異常核型的49.4%，與Zhang[8]報道的51.14%相一致。Klinefelter綜合征即先天性睪丸曲細精管發育不全，Y染色體上存在控制睪丸發育的SRY基因，表型為男性，但是由于患者核型中多余的X染色體導致Y染色體功能受到抑制，使睪丸曲精管發育受到影響，生精小管玻璃樣變和纖維化。臨床表現無精子，且有睪丸小而質硬和第二性征發育異常。劉興章等[8]報道的無精癥或隱匿性無精癥患者中檢出的165例47,XXY，未發現Y染色體AZF微缺失。本文39例47,XXY中也未檢出AZF微缺失，提示47,XXY患者的無精癥病因與Y染色體微缺失無明顯相關性。因此，對于Klinefelter綜合征患者可能沒必要進行AZF基因微缺失檢測。

國內外研究發現常染色體上存在2000多個與精子生成有關的基因[7]。一些研究發現1號染色體存在與生精功能相關的基因，包括SCP-1、tsMCAK、MTHFR、MSH4和MMP-23[9，10]。本文檢出的常染色體異常9例，均無AZF微缺失，其中1號染色體最常見，包括3例倒位和1例平衡易位，占常染色體異常的44.4%。有研究在男性不育癥，尤其是無精癥患者中1號染色體斷裂位點數相比其他常染色體要高[11]?？梢?號染色體的結構異?？赡芘c患者的無精癥具有高度相關。原因可能是1號染色體發生易位或倒位后，這些斷裂的位點如果位于生精功能的形成的相關基因，破壞了該基因的完整性，影響基因表達進而引發生精障礙，其發生機制有待日后進一步深入研究。

本文檢出AZF總缺失率為7.8%，與Ferlin[12]報道的相近。AZF至少可分為a、b、c 3個區域，分別位Yq11.23的近、中、遠端。AZFa缺失可導致唯支持細胞綜合征，病理檢查表現為間質細胞及支持細胞減少，精曲小管發育不良；AZFb缺失則會導致精原細胞和初級精母細胞成熟發育障礙，表現為無精；AZFc缺失則比較復雜，可以出現有正常精子到無精癥的表型。本文發現無精癥中AZFc異常率為50%，為最常見的缺失類型，其次為AZFb+AZFc(22.5%)、AZFa(12.5%)、AZFa+AZFb+AZFc(10.0%)和AZFb(2.5%)。以上涉及到AZFa和AZFb單個或多個區域的缺失無法獲得精子，AZFc缺失的無精癥患者則可以通過睪丸穿刺而獲成熟精子，借助卵細胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)生育后代[13，14]，但AZF缺失也有通過垂直傳播給男性子代的風險。因而，早期發現是否存在AZF缺失及缺失區域，為男性無精癥患者日后是否選擇通過ICSI輔助生育治療提供了科學依據，與此同時為AZFc缺失的患者行ICSI治療前遺傳診斷選擇女性胚胎提供了遺傳咨詢，減少非必要的有創手術，減輕患者的心理壓力和經濟負擔。

40例AZF缺失患者中正常核型占65%，劉興章等[15]也報道了997例無精癥患者中有71.6%正常男性核型，可見AZF缺失中正常核型比例高。一般來說AZF微缺失很難通過染色體核型檢測發現，因此，對無精癥患者染色體核型正常的患者有必要再進一步行AZF基因的檢測。

決定睪丸曲細精管生精細胞發育的關鍵基因存在Y染色體q11位置，該部分缺失或重排可能導致了Y染色體上一系列與生精子功能的相關基因缺失或改變。我們檢出4例核型為46,XY,del(Y)(q11.22)，細胞遺傳學上Y染色體長臂有明顯的缺失。同時涉及到不同區域的AZF微缺失，1例AZFc區缺失、2例AZFb+AZFc區缺失、1例AZFa+AZFb+AZFc區缺失。4例患者染色體核型Y染色體缺失定位于q11.22位置，分子水平表現出不同AZF的缺失，表明細胞遺傳學上對Y染色體長臂q11.22缺失的無精癥患者AZF微缺失的可能性大，且缺失的區域需要分子遺傳學確認。

綜上所述，染色體異常和Y染色體微缺失是影響男性無精癥的重要遺傳因素。AZF微缺失的無精癥患者大多核型正常，常規細胞遺傳學不能直接反應AZF微缺失情況，必需通過分子學水平明確診斷。2種方法聯合檢測有助于在接受輔助生育治療前的無精癥患者明確遺傳學病因，從而減輕患者心理負擔和避免不必要的臨床治療。