鼻咽癌患者外周血T細胞亞群及活化T淋巴細胞檢測中流式細胞術的應用價值探討

馮睿婷，趙繼智

鄭州人民醫院，河南 鄭州 450003

腫瘤免疫學研究表明，機體免疫狀態與腫瘤的發生、發展關系密切［1］。大量研究表明，惡性腫瘤患者均存在T淋巴細胞狀態異常及比例失調［2］。而T淋巴細胞亞群是機體免疫防御系統的重要組成，具有識別和清除腫瘤細胞的作用，在腫瘤免疫監測中具有重要價值［3］。T淋巴細胞的活化是機體免疫應答的核心，可誘導T細胞活化、增殖及分化，從而對特殊抗原具有直接殺傷作用，并對致敏T細胞所釋放的細胞因子具有協同殺傷作用?；诖?，本研究旨在探討采用流式細胞儀檢測鼻咽癌患者的外周血T細胞亞群及活化T淋巴細胞的應用價值，結論如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性搜集2018年1月—2019年10月于鄭州人民醫院就診的52例鼻咽癌患者臨床資料，將其作為試驗組，其中男31例，女21例；年齡42～65歲，平均年齡（51.04±4.28）歲；有吸煙史28例；臨床分期：Ⅱ期6例，Ⅲ期21例，Ⅳ期25例。納入標準：納入病例均經病理檢查確診；符合《中國鼻咽癌分期2017版（2008鼻咽癌分期修訂專家共識）》［4］中鼻咽癌的臨床分期：Ⅱ-Ⅳ期；卡氏評分＞60分，預計生存周期＞6個月；臨床資料完整。排除標準：合并嚴重傳染性疾病、其他惡性腫瘤者；放療禁忌癥者；中途退出治療者；病情不穩定，惡化速度加快，病情危重者。另選取同期體檢健康者50例作為對照組，其中男30例，女20例；年齡41～64歲，平均年齡（51.26±4.33）歲。兩組間性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑： FACScalibur流式細胞儀及配套Simultest IMK-Lymphocyte雙色免疫熒光試劑盒（美國Bection Dickinson公司）；PREP全自動溶血儀（美國Beckmancoulter公司），鼠抗人單克隆抗體CD4+/CD8+/CD3+、CD3+/CD（16++56+）、CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR，ABC溶血素。

1.2.2 檢測方法：采集所有入選者清晨空腹肘靜脈血3 ml，置于EDTA-K2抗凝真空試管中，取2支試管分設為對照管（正常人群）和試驗管（鼻咽癌患者），分別加入100μL血，各加入20μL熒光素標記的鼠抗人單克隆抗體CD4+/CD8+/CD3+、CD3+/CD（16++56+）、CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR，充分混勻。避光孵育30 min后加入2 ml溶血素，靜置8～12 min后，利用離心機以1 000 r/min離心處理5 min，除去上清液，加入2 ml磷酸緩沖液（PBS）洗滌，除去上清液，重復2次。之后再加入1 ml PBS，利用流式細胞儀自動檢測標本T細胞亞群及活化T淋巴細胞。

1.3 統計學方法

數據應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血T細胞亞群測定比較

試驗組CD3+、CD4+水平低于對照組，CD8+、CD（16++56+）水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 外周血T細胞亞群測定比較（±s） %

表1 外周血T細胞亞群測定比較（±s） %

組別試驗組（n=52）對照組（n=50）tP CD3+57.54±12.43 64.61±10.51 3.092 0.003 CD4+25.82±6.87 36.11±6.83 7.698 0.000 CD8+36.34±10.57 27.22±6.34 4.105 0.000 CD（16++56+）28.23±12.41 21.81±8.87 2.995 0.003

2.2 活化T淋巴細胞測定比較

試驗組CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 活化T淋巴細胞測定比較（±s） %

表2 活化T淋巴細胞測定比較（±s） %

組別試驗組（n=52）對照組（n=50）tP CD3+/HLA-DR 33.54±9.48 12.43±7.43 12.484 0.000 CD8+/HLA-DR 37.53±9.42 15.11±6.26 14.099 0.000

3 討論

T細胞亞群中輔助性T細胞CD4和抑制性T細胞CD8的動態平衡與相互制約是機體免疫功能運行正常的關鍵，也是維持機體免疫內環境與腫瘤微環境穩定的關鍵［5］。研究證實，T細胞亞群及活化T淋巴細胞在腫瘤的發生、發展中發揮重要的免疫調節作用［6］。

流式細胞術是臨床定量分析和分選單細胞或其他生物粒子的檢測手段，主要是通過快速測定熒光信號、側向角散射及光吸收、前向角散射，從而定量檢測細胞中DNA含量、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體、表面抗原及細胞體積等多種參數，并依據各參數結果，快速、準確、可重復性的分離不同性質的細胞，以獲得研究所需的純細胞群體，也是便捷評估、檢測腫瘤患者機體免疫狀態的有效手段［7］。本研究中應用該方法檢測鼻咽癌患者T細胞亞群，發現CD3+、CD4+淋巴細胞明顯低于正常群體，CD8+、CD（16++56+）明顯高于正常群體，提示鼻咽癌患者的免疫功能低于正常群體，T細胞亞群可作為腫瘤療效及預后的參考指標之一。分析其原因，腫瘤免疫反應主要是以T細胞亞群為主導的細胞免疫反應，CD4+淋巴細胞可輔助T細胞分化，促進單核巨噬細胞發揮抗感染作用，從而促進細胞毒性T細胞增殖，提高殺菌作用［8］；CD8+淋巴細胞抑制T細胞及殺傷性T細胞，降低患者免疫應答。當CD4+水平降低時，機體細胞免疫功能低下，抗癌能力下降；CD8+水平升高，可使腫瘤細胞發生、發展，并快速惡化、轉移［9］。同時應用流式細胞術檢測鼻咽癌患者的活化T淋巴細胞，發現，CD3+/HLA-DR、CD8+/HLA-DR水平明顯高于對照組，提示活化T淋巴細胞也可作為惡性腫瘤免疫診斷的指標之一。分析其原因，CD3是人類T細胞分化抗原，HLA-DR是主要組織相容復合體Ⅱ型MHC分子，其抗原主要表達于B淋巴細胞、活化T淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞等，當機體發生感染、抑制免疫排斥反應時均易導致T淋巴細胞活化，故HLA-DR+T淋巴細胞可反映活化T細胞含量，并可評估T細胞活化狀態及活化效率，對評估腫瘤患者免疫活化狀態具有重要的臨床參考價值［10］。

綜上所述，鼻咽癌患者的免疫功能低于正常人群，而采用流式細胞術檢測患者的外周血細胞亞群及活化T淋巴細胞，可有效反映患者腫瘤的免疫活化狀態及病情變化，具有重要臨床價值。