祁敏芳 吳慧娟 童軍衛 蔣永潑 錢玲珠 楊衛星 徐挺立
血管性癡呆是腦內長期缺氧和低灌注引起的嚴重認知功能障礙綜合征[1]。腦血管疾?。ㄈ缛毖宰渲?、出血性卒中、腦缺血缺氧)是血管性癡呆的主要臨床病因[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路對細胞生長和存活等許多方面至關重要,其異常表達會導致多種生長因子和調節因子含量發生改變[3]。丹參素是丹參水溶性成分中的主要藥效成分之一,具有改善循環、增強免疫及抗氧化等作用[4]。丹參素對血管性癡呆認知功能障礙的治療效果目前還不清楚。本研究通過制備血管性癡呆小鼠模型,探討丹參素對其作用機制,報道如下。
1.1 實驗動物 60 只SPF 級昆明種小鼠,雌雄各半,體質量20~25g,購自重慶醫科大學實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXK(渝)2019-0002,動物使用許可證號:SYXK(渝)2019-0029,動物質量合格證號:002008134。均飼養于清潔級動物房內(室溫:20~25℃,相對濕度:50%~70%),動物自由取食、飲水,自動控制光照/黑暗交替(12h/12h)。本研究通過本院倫理委員會審查,符合動物倫理學標準要求。
1.2 藥物 尼莫地平注射液(濟川藥業集團有限公司,規格:50mL:10mg,批號20191013);丹參素(原料藥,純度:99.99%,南京建成生物工程研究所,批號HT0611)。丹參素溶于生理鹽水配制成濃度為1、2、3mg/mL 的溶液。
1.3 主要試劑與儀器 星形膠質源性蛋白(S-100β)酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒、神經元特異性烯醇化酶(NSE)ELISA 檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號057458、094355);RIPA 裂解緩沖液(西安赫特生物科技有限公司,批號WB118);硝化纖維素膜(上海玉博生物科技有限公司,批號P88025);兔源PI3K、Akt 一抗(武漢博歐特生物科技有限公司,批號orb137259、orb197041);3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、羊抗鼠二抗(艾美捷科技有限公司,批號MG04-05、MG01-02);Thermo ScientificTMMultiskanTMGO 型酶標儀(美國Thermofisher 公司);BX53 型顯微鏡(日本奧林巴斯公司);LAS4000 型凝膠成像系統(美國GE Healthcare公司)。
1.4 動物建模、分組及給藥 將60 只小鼠采用隨機數字表法分為正常對照組、模型組、陽性對照組(尼莫地平注射液,2mg/kg)[5]、丹參素低(10mg/kg)、中(20mg/kg)、高(30mg/kg)劑量組[6],每組10 只。其中正常對照組不做任何處理,其余各組小鼠在禁食、禁水12h 后,3%水合氯醛麻醉,夾閉雙側頸總動脈20min后再灌注10min,重復2 次,構建血管性癡呆小鼠模型[7]。建模成功后,從第1 天開始丹參素各劑量組和陽性對照組腹腔注射相應的藥物,注射體積均為10mL/kg,正常對照組和模型組腹腔注射等體積(10mL/kg)生理鹽水,每天1 次,持續28 天。
1.5 水迷宮實驗 構建Morris 水迷宮,泳池上方放置一個和電腦相連接的攝像頭,進行觀察。給藥28天后,對各組小鼠進行5 天的水迷宮訓練,然后進行定位航行測試:將一個平臺放在水池的中央,將小鼠放入水池中,觀察其能否在60s 內到達平臺上,到達后停留30s,若未能到達,則將其強行放在平臺30s,記錄小鼠逃避潛伏期平均值(逃避潛伏期:從將小鼠放到水池中到爬上平臺的時間)[8]。
1.6 腦損傷相關因子檢測 給藥結束后,小鼠眼球取血,2000rpm 離心15min,取上清于1.5mL EP 管中,用ELISA 試劑盒檢測與腦損傷相關標志物S-100β、NSE 含量。
1.7 小鼠腦組織病理觀察 脫頸處死小鼠,取腦組織,縱向分成兩份,其中一份在4%甲醛溶液中固定48h,進行石蠟包埋、切片,厚度5μm,制作蘇木精-伊紅(HE)染色切片,鏡下觀察各組小鼠腦組織結構。
1.8 小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白水平檢測 新鮮分離的小鼠腦組織用PBS 緩沖液洗凈,采用RIPA 裂解緩沖液裂解蛋白,離心提取蛋白溶液。經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,蛋白轉移到硝化纖維素膜上,將膜放在5%脫脂奶粉溶液中封閉2h,然后用PI3K、Akt、GAPDH 一抗在4℃條件下孵育過夜,1%吐溫20溶液清洗3 次,每次10min,加入羊抗鼠二抗孵育2h,然后在凝膠成像系統上顯影。GAPDH 為內參蛋白。
1.9 統計學方法 應用SPSS 23.0 統計軟件進行數據錄入和分析,計量資料采用均數±標準差()表示,采用單因素方差分析比較,多重比較采用SNK-q檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。
2.1 各組小鼠水迷宮逃避潛伏期比較 與正常對照組比較,模型組小鼠逃避潛伏期顯著增加[(46.36±3.12)s 比(15.25±1.23)s,P<0.05];與模型組比較,丹參素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠逃避潛伏期顯著降低[(40.78±3.54)s、(34.65±3.13)s、(26.31±2.01)s、(25.23±1.75)s 比(46.36±3.12)s,P均<0.05],隨著丹參素給藥劑量的增加,小鼠逃避潛伏期呈明顯下降趨勢,具有量-效關系(P<0.05);丹參素高劑量組與陽性對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。
2.2 各組小鼠血清腦損傷相關因子S-100β、NSE 水平比較 與正常對照組比較,模型組小鼠血清腦損傷相關因子S-100β、NSE 水平顯著升高(P均<0.05);與模型組比較,丹參素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清S-100β、NSE 水平顯著降低(P均<0.05),隨著丹參素給藥劑量的增加,小鼠血清S-100β、NSE 水平逐漸降低,具有量-效關系(P<0.05);丹參素高劑量組與陽性對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。
表1 各組小鼠血清腦損傷相關因子S-100β、NSE 水平比較(ng/L,)
表1 各組小鼠血清腦損傷相關因子S-100β、NSE 水平比較(ng/L,)
注:正常對照組腹腔注射10mL/kg 生理鹽水;模型組腹腔注射10mL/kg生理鹽水;陽性對照組腹腔注射2mg/kg 尼莫地平注射液;丹參素低劑量組腹腔注射10mg/kg 丹參素;丹參素中劑量組腹腔注射20mg/kg丹參素;丹參素高劑量組腹腔注射30mg/kg 丹參素;S-100β 為星形膠質源性蛋白;NSE 為神經元特異性烯醇化酶;與正常對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與丹參素低劑量組比較,cP<0.05;與丹參素中劑量組比較,dP<0.05
圖1 各組小鼠腦組織病理觀察(HE×100)
2.3 各組小鼠腦組織病理觀察 HE 染色結果顯示,正常對照組小鼠腦組織結構正常,細胞排列整齊,無明顯空泡結構;模型組可見明顯的腦白質受損,細胞排列紊亂,視野中大量空泡結構;在給予丹參素干預后,隨著丹參素給藥劑量的增加,可見腦組織細胞排列逐漸變整齊,空泡結構逐漸減少;其中丹參素高劑量組與陽性對照組HE 染色結果基本一致。見圖1。
2.4 各組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平比較與正常對照組比較,模型組小鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達水平顯著降低(P均<0.05);與模型組比較,丹參素低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),隨著丹參素給藥劑量的增加,小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平逐漸升高,具有量-效關系(P均<0.05);丹參素高劑量組小鼠腦組織中PI3K、Akt 蛋白表達水平與陽性對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2 和圖2。
血管性癡呆為老年人的常見病,是一種與年齡相關的認知障礙。我們認為影響認知能力的關鍵因素是腦白質損傷、中樞神經系統炎癥、長期缺氧和低灌注引起的氧化應激和神經元凋亡,這也是發生血管性癡呆的主要原因[9]。
PI3K/Akt 信號通路是抑制細胞凋亡的關鍵信號轉導通路[10]。由于外界刺激激活PI3K,磷脂酰肌醇磷酸化產生第二信使:肌醇,在肌醇的控制下,Akt 從細胞質轉移到細胞膜,并被Akt 蛋白蘇氨酸位點磷酸化[11-12]。本研究發現,與正常對照組比較,模型組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平顯著降低;與模型組比較,隨著丹參素給藥劑量的增加,小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平逐漸升高,具有量-效關系。病理結果顯示,正常對照組小鼠腦組織結構正常,細胞排列整齊,無明顯空泡結構;模型組可見明顯的腦白質受損,細胞排列紊亂,視野中大量空泡結構。在給予丹參素干預后,隨著丹參素給藥劑量的增加,可見腦組織細胞排列逐漸變整齊,空泡結構逐漸減少。因此,結合蛋白免疫印跡與病理結果可以發現,小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平與血管性癡呆的恢復程度呈正相關關系,其表達量直接影響血管性癡呆的恢復情況。提示丹參素可能促進小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白的表達,從而緩解疾病的發生發展。
表2 各組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平比較()
表2 各組小鼠腦組織PI3K、Akt 蛋白表達水平比較()
注:正常對照組腹腔注射10mL/kg 生理鹽水;模型組腹腔注射10mL/kg生理鹽水;陽性對照組腹腔注射2mg/kg 尼莫地平注射液;丹參素低劑量組腹腔注射10mg/kg 丹參素;丹參素中劑量組腹腔注射20mg/kg丹參素;丹參素高劑量組腹腔注射30mg/kg 丹參素;PI3K 為磷脂酰肌醇-3-激酶;Akt 為蛋白激酶B;與正常對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與丹參素低劑量組比較,cP<0.05;與丹參素中劑量組比較,dP<0.05
圖2 各組小鼠腦組織中PI3K、Akt 蛋白水平條帶圖
逃避潛伏期可有效反映小鼠學習記憶能力。有研究顯示,血管性癡呆小鼠逃避潛伏期顯著長于假手術組小鼠,經谷胱甘肽治療后小鼠逃避潛伏期顯著縮短[13]。S-100β、NSE 為兩種重要的反應腦損傷程度的細胞因子。研究發現,假手術組大鼠血清S-100β、NSE 兩種細胞因子較血管性癡呆組顯著降低,其表達量與腦組織病理損傷程度呈負相關;在給予相應的治療后,S-100β、NSE 含量降低[14]。本研究結果顯示,與正常對照組比較,模型組小鼠逃避潛伏期延長,血清S-100β、NSE 水平顯著升高;在給予丹參素干預后,小鼠逃避潛伏期縮短,血清S-100β、NSE水平顯著降低,且隨著丹參素劑量的增加,逃避潛伏期、血清S-100β、NSE 水平變化具有量-效關系。說明丹參素能顯著改善血管性癡呆小鼠的腦損傷。
綜上所述,丹參素可能通過PI3K/Akt 信號通路,調節PI3K、Akt 蛋白及腦損傷相關細胞因子表達,以改善血管性癡呆小鼠的腦損傷。