三七總皂苷經miR-24 靶向C-myc 對骨關節炎模型大鼠軟骨細胞凋亡與增殖的影響

陳偉達 石 瑋 楊繼國 陳 騰

骨關節炎是骨科臨床常見病，嚴重影響患者生活質量[1]。微小核糖核酸（miRs）是小的非蛋白質編碼RNA，其與靶mRNA 的30 個非翻譯區（UTR）結合并且被認為是新的基因表達調節劑。作為血管內皮細胞中發現的缺氧敏感性miR，微小核糖核酸-24（miR-24）與軟骨細胞分化和增殖有關[2]。原癌基因（C-myc）可編碼轉錄因子，以調節轉錄活性和細胞增殖、生長和凋亡[3]。C-myc 過表達可促進促炎介質的過量產生，如腫瘤壞死因子-α，白細胞介素-1β（IL-1β），一氧化氮（NO）和前列腺素。研究[4]證實，C-myc可作為誘導軟骨細胞凋亡的誘導劑，而軟骨細胞凋亡與骨關節炎的嚴重程度相關性明顯。文獻[5]報道，miR-24 可抑制C-myc 表達，進而調節軟骨細胞增殖，生長和凋亡。三七總皂苷其主要成份為人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1，作用為活血祛瘀，通脈活絡[6]。具有抑制血小板聚集和增加腦血流量的作用，常用于腦血管后遺癥，視網膜中央靜脈阻塞，眼前房出血等[7]。研究[8]表明，三七總皂苷能夠保護骨關節炎大鼠的軟骨細胞免于變性。本研究探討三七總皂苷經miR-24 靶向C-myc 對骨關節炎大鼠軟骨細胞凋亡與增殖的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 清潔級雄性SD 大鼠購自吉林大學實驗動物中心，8 周齡，體質量180～220g，動物生產許可證號：SCXK（吉）2018-0002，動物使用許可證號：SYXK（吉）2018-0023，動物質量合格證號：2019012706，適應性飼養1 周后用于本實驗。

1.2 藥物 三七總皂苷（原料藥，純度99%，杭州甫洛生物科技有限公司，批號CAS-2037-50）。

1.3 試劑 低葡萄糖Dulbecco 改良Eagle's 培養基（L-DMEM）溶液（美國Gibco 公司，批號M0063）；Ⅱ型膠原酶（美國Sigma-Aldrich 公司，批號SA66143）；鏈霉素和青霉素（武漢Procell 生命科技有限公司，批號AW65987、AW145624）；胎牛血清（FBS）、放射免疫沉淀測定裂解緩沖液、CCK-8 試劑（碧云天生物技術公司，批號BF24593、BF20119、BF11665）；FITC 膜聯蛋白V 凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen 公司，批號MB58741）；TRIzol 試劑、RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒（美國賽默飛世爾科技有限公司，批號14865、14654）；SYBR Premix Ex Taq 熒光定量PCR 試劑盒、二乙基焦碳酸酯處理水（日本Takara 公司，批號T0037、T2548）；C-myc 單克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology 公司，批號P60253、HC1012）；辣根過氧化物酶綴合的山羊抗大鼠二抗、HRP 底物顯色試劑盒（美國Proteintech 公司，批號SA00001-1、WBKLS0100）。

1.4 儀器 HF90 型CO2培養箱（力新儀器上海有限公司）；IX83 型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Bio-Tek Synergy 2 型酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；FACS Calibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；NanoDrop 2000C 型分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）；ChemiDoc XRS 型凝膠成像系統、CFX 96TM 型實時PCR 系統（美國伯樂公司）。

2 實驗方法

2.1 骨關節炎大鼠模型制備 SD 大鼠麻醉后仰臥固定于手術臺上，兩側后肢膝關節內側備皮，曲屈大鼠膝關節，于關節兩側進針，在1、4、7 天分別將0.2mL 4%木瓜蛋白酶水溶液注射到膝關節腔內（刺破關節腔時有突破感，注射藥物時無阻力）。隨后進行膝關節Lequesne MG 評估級別，平均評分＞40 說明大鼠膝關節骨性關節炎模型建立成功[9]。

2.2 骨關節炎大鼠軟骨細胞獲取及培養 脫臼處死骨關節炎模型大鼠，無菌收集兩側膝關節的全部軟骨組織，使用眼科剪刀將其均勻地切成1mm×1mm×1mm的片段。用L-DMEM 溶液洗滌所獲骨關節炎大鼠軟骨細胞。然后，將骨關節炎大鼠軟骨細胞轉移到含有1.5g/L Ⅱ型膠原酶的新培養皿中，然后將其置于培養箱中在37℃下孵育4h，接著將細胞懸浮液消化，用不銹鋼過濾器（150 目）過濾，以3000rpm 的速度離心10min，去上清液。加入150U/mL 鏈霉素和150U/mL青霉素以及13% FBS 孵育24h，更換營養液，之后每3 天更換1 次營養液。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長直至細胞匯合達到85%后，收集細胞用于后續試驗。

2.3 分組設計 骨關節炎軟骨細胞組：取10mL 骨關節炎軟骨細胞組液（細胞濃度為5×106/mL）于10%FBS 的DMEM 培養液中，置于CO2培養箱（37℃、5%CO2、20%O2）；三七總皂苷低、中、高劑量組細胞培養方法同骨關節炎軟骨細胞組，分別加入三七總皂苷（最終濃度分別為：100、200、400μg/mL）[10]。各組細胞分別設6 個平行樣本，培養72h。

2.4 骨關節炎軟骨細胞活力檢測 CCK-8 測定骨關節炎軟骨細胞活力。各組骨關節炎軟骨細胞培養結束后，每組加入10μL CCK-8 染色劑，按照制造商的說明書操作。用于比色分析的裝置是Bio-Tek Synergy 2 型酶標儀，波長為450nm，讀取吸光度（OD）值。細胞存活率=（實驗組OD 值/空白組OD值）×100%?？瞻捉M為蒸餾水調零組。

2.5 骨關節炎軟骨細胞菌落數水平測定 選擇處于指數生長期的細胞并通過移液將其懸浮于單個細胞中，然后接種到10cm 培養皿中。用梯度因子進一步稀釋細胞懸浮液，將約500 個細胞加入培養皿中，在37℃下培養2～3 周直至出現可見的菌落，用PBS 輕輕洗滌培養皿兩次，將細菌用5mL 甲醇固定15min，用吉姆薩染色10～30min，然后計數。計數含有至少50 個細胞的活菌落。

2.6 骨關節炎軟骨細胞凋亡水平測定 FITC 膜聯蛋白V 凋亡檢測試劑盒用于測定細胞凋亡率。將培養結束的骨關節炎軟骨細胞（每孔5×105個細胞）接種到6 孔板中，重懸于1X 結合緩沖液，與5μL 異硫氰酸熒光素偶聯的膜聯蛋白V 和5μl PI 在黑暗中于25℃下溫育15min。在1h 內進行流式細胞術分析。

2.7 骨關節炎軟骨細胞miR-24、C-myc mRNA 水平測定 細胞培養結束后，使用TRIzol 試劑提取總RNA。根據制造商的說明，使用RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒進行逆轉錄，使用SYBR Premix Ex Taq 熒光定量PCR 試劑盒檢測mRNA 水平。引物由日本Takara 公司設計合成。使用以下引物：miR-24 正向5'-TTCCCCAGCAACTACGTGAC-3'和miR-24 反 向5'-TCTAACAACTGAATGGGCGG-3'；C-myc 正向5'-CACGTCTCAGTGCATCACAGA-3'和C-myc 反 向5'-GTGCAGGGTCCGAGGTCCATG-3'；U6 正向5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' 和U6反向5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。將miR-24、C-myc mRNA 的水平標準化至U6。使用實時PCR 系統和含有cDNA 模板引物，SYBR Premix Ex Taq 試劑、二乙基焦碳酸酯處理水的PCR 混合物進行PCR。使用以下熱循環條件：94℃持續10s 隨后進行40 個循環，94℃10s，60℃持續20s 和72℃持續10s。使用2-ΔΔCt 方法計算miR-24、C-myc mRNA 表達水平。

2.8 骨關節炎軟骨細胞C-myc 蛋白水平測定 使用放射免疫沉淀測定裂解緩沖液從骨關節炎軟骨細胞中提取蛋白質，使用分光光度計定量總蛋白質濃度，通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離來自每種提取物的等量（100μg）蛋白質，然后在300mA 下電轉移到聚偏二氟乙烯膜上1h。用5%脫脂乳在室溫下封閉1h 后，將印跡與C-myc 一抗（1：1000 稀釋）以及β-actin 單克隆抗體（1：1000 稀釋）在4℃過夜，與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗大鼠二抗（1：2000 稀釋）孵育后，使用HRP 底物顯色試劑盒以及凝膠成像系統顯現蛋白質條帶。使用ImageJ 軟件版本進行蛋白質條帶的灰度值分析以定量蛋白質水平。

2.9 統計學方法 應用SPSS 23.0 統計軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q 檢驗；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組骨關節炎軟骨細胞OD 值、存活率比較與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組OD 值增加、存活率升高（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組OD 值、存活率逐漸升高（P均＜0.05）。見表1。

3.2 各組骨關節炎軟骨細胞菌落數比較 與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細胞菌落數增加（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細胞菌落數逐漸增加（P均＜0.05）。見表2，圖1。

表1 各組骨關節炎軟骨細胞OD 值、存活率比較（）

表1 各組骨關節炎軟骨細胞OD 值、存活率比較（）

注：骨關節炎軟骨細胞組為骨關節炎軟骨細胞；三七總皂苷低劑量組為骨關節炎軟骨細胞+100μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷中劑量組為骨關節炎軟骨細胞+200μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷高劑量組為骨關節炎軟骨細胞+400μg/mL 三七總皂苷；OD 為吸光度；與骨關節炎軟骨細胞組比較，aP＜0.05；與三七總皂苷低劑量組比較，bP＜0.05；與三七總皂苷中劑量組比較，cP＜0.05

表2 各組骨關節炎軟骨細胞菌落數、凋亡率比較（）

表2 各組骨關節炎軟骨細胞菌落數、凋亡率比較（）

注：骨關節炎軟骨細胞組為骨關節炎軟骨細胞；三七總皂苷低劑量組為骨關節炎軟骨細胞+100μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷中劑量組為骨關節炎軟骨細胞+200μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷高劑量組為骨關節炎軟骨細胞+400μg/mL 三七總皂苷；與骨關節炎軟骨細胞組比較，aP＜0.05；與三七總皂苷低劑量組比較，bP＜0.05；與三七總皂苷中劑量組比較，cP＜0.05

3.3 各組骨關節炎軟骨細胞凋亡率比較 與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組凋亡率降低（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組凋亡率逐漸降低（P均＜0.05）。見表2。

3.4 各組骨關節炎軟骨細胞miR-24、C-myc mRNA表達水平比較 與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細胞miR-24 mRNA 表達量增加（P均＜0.05），C-myc mRNA 表達量降低（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細胞miR-24 mRNA 表達量逐漸升高，C-myc mRNA 表達量逐漸降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組骨關節炎軟骨細胞miR-24、C-myc mRNA、C-myc 蛋白表達水平比較（）

表3 各組骨關節炎軟骨細胞miR-24、C-myc mRNA、C-myc 蛋白表達水平比較（）

注：骨關節炎軟骨細胞組為骨關節炎軟骨細胞；三七總皂苷低劑量組為骨關節炎軟骨細胞+100μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷中劑量組為骨關節炎軟骨細胞+200μg/mL 三七總皂苷；三七總皂苷高劑量組為骨關節炎軟骨細胞+400μg/mL 三七總皂苷；miR-24 為微小核糖核酸-24；C-myc 為原癌基因；C-myc 為原癌基因；與骨關節炎軟骨細胞組比較，aP＜0.05；與三七總皂苷低劑量組比較，bP＜0.05；與三七總皂苷中劑量組比較，cP＜0.05

3.5 各組骨關節炎軟骨細胞C-myc 蛋白表達水平比較 與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細胞C-myc 蛋白表達降低（P均＜0.05）；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細胞C-myc 蛋白表達量逐漸降低（P均＜0.05）。見表3。

4 討論

三七總皂苷源于三七的干燥根及根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功能。研究表明，三七總皂苷具有抗炎、抗癌、抗氧化和抗細胞凋亡等[11]。三七總皂苷可抑制SNP 刺激的大鼠軟骨細胞凋亡并改善大鼠骨關節炎模型中的軟骨退化[12]。本研究結果顯示，與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組OD值、存活率、細胞菌落數升高，凋亡率降低；隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組OD 值、存活率、細胞菌落數逐漸升高，凋亡率逐漸降低。說明三七總皂苷具有抗骨關節炎大鼠軟骨細胞凋亡特性，并能促進骨關節炎大鼠軟骨細胞增殖，而減輕細胞凋亡過程可以緩解軟骨退變的進展。

圖1 各組骨關節炎軟骨細胞菌落數比較（吉姆薩染色×400）

通過對各組軟骨細胞miR-24 mRNA 分析結果顯示，與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細胞miR-24 mRNA 表達水平增加。結合前述各組軟骨細胞凋亡、增殖水平；推測miR-24 可以促進細胞增殖，并抑制軟骨細胞凋亡。動物實驗證實，miR-24 可能在促進增殖和預防軟骨細胞凋亡中起重要作用[13]。miR-24 是一種潛在的基因和藥物治療靶點，能夠抑制腦梗死大鼠腦組織細胞凋亡，此外，miR-24 所起的抗細胞凋亡作用也可能在細胞增殖中起作用[14]。本研究結果顯示，隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細胞miR-24 mRNA 逐漸升高。說明三七總皂苷能促進骨關節炎大鼠軟骨細胞miR-24 mRNA 高表達，進而起到抑制軟骨細胞凋亡的作用。

動物實驗表明，骨關節炎大鼠軟骨細胞C-myc mRNA 和蛋白表達上調[15]。體外細胞試驗顯示[16]，miR-24 可能下調C-myc 表達，從而抑制骨關節炎的發展。文獻報道，C-myc 高表達導致細胞遷移和乳腺癌細胞系侵襲的顯著增加；C-myc 能夠參與干細胞更新、代謝、生長、增殖、凋亡、血管生成、分化、翻譯和核糖體生物發生；miR-24 能夠通過結合其3'-UTR 來下調C-myc[17]。本研究結果顯示，與骨關節炎軟骨細胞組比較，三七總皂苷低、中、高劑量組細胞mRNA 和C-myc 蛋白降低；且隨著三七總皂苷劑量的增加，三七總皂苷各劑量組細胞C-myc mRNA 和蛋白逐漸降低。說明三七總皂苷能靶向上調miR-24 mRNA 表達，抑制C-myc mRNA 和蛋白的表達。

綜上所述，三七總皂苷能抑制骨關節炎模型大鼠軟骨細胞凋亡，促進骨關節炎大鼠軟骨細胞增殖；其機制可能與三七總皂苷能靶向上調miR-24 mRNA 進而抑制C-myc mRNA 和蛋白的表達有關。