單增李斯特菌生物膜形成及其調控機制研究進展

胡麗麗，董慶利，夏陽，張帥帥，楊靜遠，王真，劉陽泰

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，簡稱單增李斯特菌，是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于自然界中，可污染奶制品、肉制品、水產品以及即食食品等，是重要的食源性致病菌之一[1]。當攝入被單增李斯特菌污染的食品后，孕婦、嬰幼兒及老人等免疫低下人群極易罹患李斯特菌病，其致死率高達23.6%[2]。2016年，歐盟報告了李斯特菌病的確診病例約為2 500例[3]。自2013—2017年以來，我國食源性疾病監測網絡報告的相關感染病例為211例，呈散發狀態[4]。

生物膜(biofilm)是由細菌和自身分泌的胞外聚合物質(extracellular polymeric substances，EPS)組成，可黏附在生物及非生物材質表面,是具有三維立體空間結構的細胞群體[5]。單增李斯特菌可在食品接觸表面如不銹鋼、聚丙烯形成生物膜，同時生物膜對消毒劑、低溫等不利環境耐受性強，可以長時間存活，容易形成持久性的污染源頭，給食品安全造成潛在的隱患[5]。因此，近年來對其生物膜的組成、形成差異、耐藥性、調控機制等研究廣泛開展。本文將介紹單增李斯特菌生物膜的形成過程及其影響因素，同時對生物膜的多種調控機制進行總結分析，為其相關研究提供一定參考。

1 細菌的生物膜及其形成過程

自然界的多數細菌可形成生物膜，是一種抗逆保護機制。細菌形成生物膜且可以長期存活的原因可總結為4點：一是自然環境中往往營養匱乏，不利于細菌的大量生長繁殖。細菌為了能夠存活會放棄最佳生長狀態，以營養缺陷型即生物膜形式存在；二是生物膜是一個具有穩定的含水量、氧氣含量的微環境，適宜細菌的生長；三是生物膜的細胞以協同合作的方式互相接觸、催化、基因交換，最終使得群體適應環境而生存；四是生物膜分泌的EPS能有效地阻止抗生素、消毒劑滲透以及延緩其擴散，使內部細菌得以存活[6]。

研究發現細菌的生物膜形成是循環往復的動態演變過程，通?？煞譃?個階段：可逆黏附、不可逆黏附、微菌落的形成、生物膜的成熟、生物膜的分散[7]，如圖1所示。少數的菌體首先通過范德華力、靜電相互作用、疏水相互作用黏附在介質表面，逐漸形成微小的菌落。隨著菌體大量生長繁殖并分泌EPS，生物膜形成多層的結構，其生理代謝過程發生改變。在生物膜的成熟階段，菌體之間相互作用增強，細胞被完全包裹在EPS內形成結構復雜的聚集體。聚集體之間的空隙作為營養物質、代謝廢物及信號分子的通路。當營養成分缺乏、氧氣不足會導致內部菌體開始逐漸死亡，生物膜結構開始解離分散。隨后，游離態菌體又開始新一輪的黏附生長過程[5,7]。

圖1 細菌的生物膜形成過程Fig.1 The biofilm forming process of bacteria

細菌生長的環境復雜多變，同時各種細胞代謝途徑有明顯差異。單增李斯特菌作為重要的食源性致病菌，在不同環境下，其獨有的反饋機制會做出正向或反向調控，從而影響生物膜的整個形成過程。

2 單增李斯特菌生物膜形成的影響因素

諸多因素會影響單增李斯特菌生物膜形成的整個過程，通?？煞譃榄h境因素和菌株特性，如溫度、營養成分、細胞表面疏水性、血清型等。單增李斯特菌所處的環境復雜多變，往往是多種因素的疊加組合，因此理解培養條件對其生物膜的形成量、微觀結構、細胞形態等的影響有利于生物膜的預防和控制。

2.1 環境因素

溫度不僅影響單增李斯特菌種群密度的變化，也是其生物膜形成的重要因素之一。溫度升高時，單增李斯特菌的生長代謝速率會加快，導致一定時間內其生物膜形成量隨之增加[8]。然而部分研究表明，營養缺乏的培養條件下，溫度過高反而不利于生物膜的形成，42 ℃下不銹鋼表面附著的活細胞數量低于30 ℃[9]。培養基經過稀釋后，單增李斯特菌在12 ℃的生物膜形成量顯著高于20、30 ℃，可能是低溫促進了單增李斯特菌生物膜形成[10]。此外，通過細胞染色方法發現，營養缺乏的培養基內其生物膜的EPS及非活性細胞數量高于腦心浸液肉湯(brain heart infusion，BHI)培養基[9]，由于生物膜結構是細胞及EPS的聚集體，其形成量高并不代表活細胞數量多。

營養成分對單增李斯特菌生物膜形成有著至關重要的作用。人工培養基如BHI、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)、營養肉湯(meat broth，MB)培養基等可為生物膜的形成提供豐富的營養物質。由于培養基的碳源、氮源、無機鹽成分有所差異，導致單增李斯特菌生物膜形成量各有不同。研究發現在BHI培養基中單增李斯特菌的生物膜形成量最高[11]。為了更好地模擬真實環境下生物膜的形成，逐漸采用食品基質作為研究對象。常見的碳水化合物對單增李斯特菌的生物膜形成均有一定促進作用，其中木糖醇和魔芋精粉的作用較為顯著[12]。然而高濃度的葡萄糖會減少單增李斯特菌生物膜的活細菌數量，增加其EPS的分泌[13]。此外在肉制品中，豬肉汁相較于雞肉汁與牛肉汁，能顯著提高單增李斯特菌生物膜的形成量，這可能與該研究所用菌株多數分離于豬肉有關[14]。

接觸表面的材質類型也是影響菌體黏附數量的關鍵因素之一。不同材料的表面特性(疏水性、表面粗糙度)可顯著影響菌體的黏附效果。多數研究表明，單增李斯特菌更傾向于附著在親水性材質上，如不銹鋼、玻璃表面，只有少量的菌株可在疏水性材質如聚苯乙烯上形成生物膜[15]。橡膠材料因其表面疏水性高且粗糙度較低，其生物膜形成量低于不銹鋼、聚乙烯表面[16]。通過掃描電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀測到不同材質表面形成的生物膜微觀結構有明顯差異，其結構有貼壁細胞單層結構、蜂窩狀結構、蘑菇狀結構、針織鏈結構、無組織聚集結構等[17]。由此可見，材質的表面特性會影響單增李斯特菌的生物膜形成及其結構。

另外，培養方式、環境滲透壓也會影響單增李斯特菌的生物膜形成量。與搖床培養相比，靜置條件下單增李斯特菌生物膜在BHI培養基中的形成顯著提高[18]。低濃度的NaCl可促進單增李斯特菌生物膜的形成，但NaCl濃度過高時則起到抑制作用[12]。環境的脅迫因素會觸發單增李斯特菌的應激反應，促使形成更多的生物膜以抵抗不利環境。

2.2 菌株特性

單增李斯特菌的血清型與生物膜形成能力有一定關聯。根據菌體抗原和鞭毛抗原單增李斯特菌可分為16個血清型，不同血清型的致病能力不同，其中與李斯特菌病爆發相關的常見血清型是1/2a、1/2b、4b。MELONI等[19]研究了分離于肉類加工廠的40株單增李斯特菌菌株，發現在BHI培養基中血清型為1/2a、1/2b、4b的菌株比1/2c血清型具有更高的黏附能力。此外，4b血清型的菌株生物膜形成能力高于1/2a血清型[20]。當培養條件的溫度、營養成分改變時，血清型對單增李斯特菌生物膜形成影響作用較小。此外，不同分離來源的單增李斯特菌的生物膜形成能力也有所差異。部分單增李斯特菌菌株在經過消毒劑、低酸等環境脅迫因素后，菌株的毒性、抗性增強的同時其生物膜形成量增加[21]。食品工廠環境中長期持留的單增李斯特菌菌株，在較短培養時間內其黏附細胞數量多于散發菌株。然而隨著培養時間增加，兩者生物膜形成量無顯著差異[22]。這表明持留菌株對于生物膜的早期形成有一定促進作用，利于菌體的黏附。

單增李斯特菌的表面疏水性、得失電子能力、菌體的聚集性和泳動能力會對其黏附和生物膜產生一定影響。在生物膜形成的初始黏附階段，單增李斯特菌通過鞭毛、菌毛和纖毛等絲狀結構體增強菌體與接觸面的黏附，利于生物膜的形成及發展。在聚苯乙烯表面的生物膜形成能力與細胞表面疏水性呈正相關關系，隨菌株的表面疏水性增加而增加[23]。值得注意的是，細菌的細胞壁組成會隨溫度發生變化，導致其表面疏水性改變。同時，單增李斯特菌在20～25 ℃時會產生鞭毛利于細菌的趨化運動及細胞聚集[24]。因此當探究細胞表面疏水性對生物膜的影響時，需要考慮溫度、培養介質等因素的共同作用、相互影響。

3 單增李斯特菌生物膜形成的調控機制

單增李斯特菌的生物膜形成過程包含了多種復雜的調控機制，如基因調控、蛋白表達、EPS分泌、群體感應系統調節等。深入研究生物膜的形成機制，對于生物膜的防控具有重要意義。

3.1 基因調控

當前對單增李斯特菌生物膜調控基因的研究，主要集中在探究已知功能基因以及未知基因在生物膜形成的作用。已有大量研究表明，單增李斯特菌的應激反應調節因子、毒力基因、鞭毛基因等缺失后，細胞的附著數量及生物膜的形成量減少。表1總結了與單增李斯特菌生物膜形成的相關基因及調節因子。

在單增李斯特菌中，由sigB基因編碼的SigB是受到環境脅迫時的主要調節因子。在適宜環境時RsbW蛋白能使RsbV蛋白磷酸化，使sigB的活性受到抑制。當RsbV蛋白去磷酸化并與RsbW蛋白結合，促使sigB因子被釋放并裝載到RNA核心酶上，從而調控生理代謝相關基因的表達，使其在低溫、低酸、高滲等環境下生存[25]。生物膜作為細菌的一種抗逆機制，sigB基因的調控與生物膜形成之間有著非常重要的關聯。ΔsigB突變株的生物膜形成能力顯著低于野生型菌株[26]。通過對野生型菌株與ΔsigB突變株的轉錄水平進行比較，發現大量的基因存在顯著性差異，且差異主要體現在核糖體的生物合成、翻譯、細胞組件合成，氨基酸、無機離子和碳水化合物的運輸與代謝、部分未知的功能基因等[26]。然而sigB基因對生物膜的調控機制研究目前主要集中在原始菌株與突變菌株表型的差異比較。隨著研究技術的不斷發展，利用基因組學、轉錄組學等對具體的調控途徑進行探究將能更深刻了解生物膜的形成機制。

表1 單增李斯特菌生物膜形成的功能基因及作用Table 1 Functional genes and their effects on the formation of Listeria monocytogenes biofilm

由prfA基因編碼的PrfA蛋白是單增李斯特菌最重要的毒力調控因子，在感染宿主細胞的過程中可調控大多數毒力基因進行轉錄，如hly、inlA、inlB、plcA、actA等。在ΔprfA突變株中PrfA蛋白不具有活性，進入宿主細胞后不能正向調控ActA蛋白的表達，使單增李斯特菌不能在細胞間進行擴散[34]。此外，ΔprfA突變株會影響生物膜形成的初始表面黏附以及延緩生物膜的形成，但攜帶PrfA蛋白的重組單增李斯特菌可恢復生物膜形成能力[35]。ActA蛋白作為重要的毒力因子，研究發現ΔactA缺失株會降低單增李斯特菌的細胞聚集，減少生物膜的形成量。此外，SigB調控因子可直接或間接調節如prfA、inlA、inlB等毒力基因，這些功能基因在單增李斯特菌生物膜形成中發揮著重要作用。

鞭毛基因調控單增李斯特菌的鞭毛合成，如flaA基因編碼鞭毛蛋白作為鞭毛的結構亞基，motA、motB基因可調控鞭毛的運動能力[36]。研究表明，ΔflgL與ΔmotA的單增李斯特菌突變株會降低細胞的表面附著，影響生物膜形成過程的初始黏附階段[37]。ΔflaA、ΔmotAB突變株與野生型菌株相較，其生物膜形成量降低，在半固體瓊脂上菌落直徑明顯減小[38]?？偟膩碚f，鞭毛的存在利于單增李斯特菌克服表面張力運動到營養物質的表面，互相聚集從而促進生物膜的早期形成。

3.2 EPS的調控作用

單增李斯特菌的EPS主要是由胞外多糖(exopolysaccharides)、蛋白質、核酸組成的復雜混合物，可占生物膜干重的90%以上。作為生物膜的三維基本結構，其對細菌的表面黏附、細胞聚集、保護屏障、吸收營養物質等有著至關重要的作用[39]。

胞外多糖是細菌生物膜EPS的主要成分，作為生物膜的三維結構支架可提高生物膜的機械穩定性和細菌細胞對接觸表面的黏附力[39]。BRAUGE等[40]研究發現，單增李斯特菌的胞外多糖成分為磷壁酸。第二信使環二鳥苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)能夠正向調控胞外多糖的產生，細胞內高水平的c-di-GMP可以促進胞外多糖的合成從而促進生物膜的形成，而低水平的c-di-GMP則通過增強細菌的活力促使生物膜分散，轉向游離態[41]。當單增李斯特菌黏附在接觸表面時，細胞中的磷壁酸被吸收成為生物膜的EPS組成成分[42]。

蛋白質也是單增李斯特菌生物膜EPS的重要組成部分，與細胞的初始表面附著有重要關聯。LONGHI等[43]用蛋白酶處理單增李斯特菌生物膜后，發現生物膜的形成受損，同時會誘導細胞分散。單增李斯特菌可轉錄翻譯多種蛋白質，在生物膜的黏附、形成發揮重要作用，如內化素A(internalin，InlA)是一種細胞壁結合蛋白，與單增李斯特菌對宿主細胞的侵襲和黏附相關?？删幋a非功能作用的截短InlA的單增李斯特菌菌株，其生物膜形成能力顯著高于野生型菌株[44]。Bap蛋白廣泛存在于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌中參與生物膜的形成，單增李斯特菌中存在與Bap蛋白結構特征相似的蛋白質BapL，可以促進生物膜的形成[45]。

胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)是單增李斯特菌生物膜EPS的重要組成結構，其可能的來源是培養環境或溶解破裂的細胞。eDNA通過特定的方式與肽聚糖的N-乙酰葡萄糖胺相互作用，參與生物膜形成的黏附過程，同時作為高分子物質可以使細菌表面的黏附位點飽和，形成致密的生物膜結構。另外，用脫氧核糖核酸酶處理單增李斯特菌后，細菌的初始附著受到抑制，并延緩了生物膜的形成[46-47]。

3.3 群體感應系統的調節

群體感應(quorum sensing，QS)系統廣泛存在細菌中，是細胞與細胞之間的信息交流，可調控的生理特性包括細菌的生物膜形成、毒力與侵襲性、細菌素產生、耐藥性、形態轉換等[48]，如圖2所示。

根據信號分子的種類，細菌的群體感應可分為3種。一是存在于革蘭氏陰性菌中以高絲氨酸內酯(N-acyl homoserine lactones，AHL)信號分子介導的種內群體感應系統。當AHL濃度達到一定閾值時，可與LuxR家族的DNA結合受體蛋白相互作用，從而介導特定的基因表達[49]；二是革蘭氏陽性菌中，以自誘導寡肽(autoinducing peptide，AIP)介導的群體感應系統。AIP的前體肽在細胞內合成后，需要經過一系列的轉運修飾才具備活性。隨后通過ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)運輸到胞外，被細胞膜上的雙組分組氨酸激酶識別從而引發磷酸化反應[50]；三是存在于革蘭氏陽性菌與陰性菌的呋喃糖基硼酸二酯(autoinducer-2，AI-2)群體感應系統，在細菌之間發揮重要的信號傳遞和交流作用[51]。

圖2 細菌的群體感應過程Fig.2 The quorum sensing process of bacteria

在革蘭氏陽性菌中，金黃色葡萄球菌的QS系統研究較為深入，包括AIP及AI-2兩種。由信號分子AIP介導的雙組分信號轉導系統agr系統被證實與毒力基因、生物膜形成有關。首先由agr操縱子編碼的agrBDCA 4種蛋白質，其中AgrB是一種膜結合肽酶，參與AgrD加工合成AIP并輸出釋放。AIP在細胞外積累到一定濃度后激活由組胺酸激酶(AgrC)和反應調節器(AgrA)組成的雙組分系統，被磷酸化的AgrA蛋白分別激活P2和P3啟動子進而編碼RNA Ⅲ，最后由RNA Ⅲ轉錄激活毒力因子的產生及降低表面黏附相關基因的表達，從而增加毒性與減少生物膜的形成[52]。單增李斯特菌也含有agrB、agrD、agrC、agrA基因，研究發現基因agrD或agrA缺失的單增李斯特菌EGDe菌株的成膜能力和毒力均顯著降低[53]。在ΔagrD突變體中，毒力相關基因(hlyA、actA、prfA和inlA)的表達下調，細菌的毒力下降[54]。盡管革蘭氏陽性菌的agr系統在多種調控途徑上存在相似性，但是不同的陽性菌中也存在一定差異。單增李斯特菌的agr系統調控機制還需更多的基礎研究去證實。此外，種間交流的信號分子也會影響單增李斯特菌的生物膜形成，在培養基加入一定濃度的AHLs后，其生物膜形成量顯著提高[55]。

4 結論與展望

單增李斯特菌可在常見的食品加工設備表面形成生物膜且難以清除，其有效控制是食品工業的難題。同時環境因素與菌株特性的共同作用影響其生物膜的形成，研究其形成差異、內部的復雜調控機制對食品加工過程中其預防控制具有重要的意義。本文通過歸納得到如下結論和展望：

(1)食品工廠的加工過程中，利用溫度、pH、材質特性等重要影響因素去抑制單增李斯特菌的黏附與生物膜形成仍是未來研究的主要方向。此外，EPS的存在顯著提高生物膜的存活時間，開發新型的酶制劑、消毒劑破壞生物膜的結構以達到高效安全的清除效果，其應用前景也十分廣泛。

(2)基因調控和蛋白質表達參與單增李斯特菌的生物膜形成過程，然而這些功能基因的具體調控途徑、調控階段尚未可知，同時還有許多未知基因的功能作用尚不明確。除了表型差異的相關研究，利用轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等組學技術將有助于破譯單增李斯特菌生物膜形成的復雜機制。

(3)QS系統對于單增李斯特菌的生物膜形成有至關重要的調節作用，其信號分子的合成、轉運及調控仍有待深入研究。此外，在真實環境中往往是多種細菌形成的復合生物膜，研究不同信號分子的種間交流，這將有助于理解同一生態位的不同細菌之間的相互作用。