胞質型肽聚糖識別蛋白RfPGRP-L2在維持紅棕象甲腸道菌群穩態中的作用

肖 蓉, 王興紅, 李雄偉, 劉惠惠, 魯盛平,侯有明, 石章紅,*

(1. 福建農林大學, 閩臺作物有害生物防控國家重點實驗室, 福州 350002;2. 福建農林大學植物保護學院, 福建省昆蟲生態學重點實驗室, 福州 350002)

微生物是自然界中常見的一種生命體，通常以“微生物群落”的方式共存。在動物的腸道中棲息著包括細菌、古菌、病毒、真菌和原生生物等多種微生物，其中細菌是主要的微生物類群，常被稱為腸道菌群(Lee and Brey, 2013)。昆蟲與腸道菌群之間的互作是昆蟲適應環境和進化成功的重要因素?，F有證據表明，腸道菌群對昆蟲的生理適合度有很顯著的影響作用(Engel and Moran, 2013; Douglas, 2015; 陳勃生等, 2017; 石章紅和侯有明, 2020)。例如，腸道菌群可以調節昆蟲的營養代謝、生長發育、免疫活性、器官穩態維持、壽命以及交配覓食行為(Youetal., 2014; Schretteretal., 2018; Lynch and Hsiao, 2019; 高歡歡等, 2020)。腸道是宿主與外界環境進行物質交換的主要場所，外界環境中的非腸道微生物會隨著食物進入昆蟲腸道。因此，宿主需要快速且精準地識別并清除非腸道細菌以維持其腸道菌群穩態。因為動物腸道菌群的結構組成和數量可以隨著內外各種因素的波動而不斷動態變化，所以腸道菌群穩態通常是指腸道菌群的結構組成與宿主健康之間的一種動態平衡狀態，通常從腸道細菌的數量和不同種類細菌的相對豐度這兩個角度來進行衡量(Ryuetal., 2008; Buchonetal., 2013)。已有研究證實昆蟲免疫系統在宿主腸道菌群穩態的維持和調控中扮演關鍵角色(Chenetal., 2019; Xiaoetal., 2019)。例如，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和斯氏按蚊Anophelesstephensi的腸上皮細胞能夠通過分泌產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)(Oliveiraetal., 2011; Leeetal., 2013)和抗菌肽(Ryuetal., 2008)來調控腸道菌群的組成和數量。

縱觀當前關于昆蟲腸道菌群的相關研究報道，不難發現對于昆蟲宿主如何調控和維持其健康的腸道菌群穩態這方面的科學問題研究關注相對很少，而且非常有限的相關報道也是主要來自于模式昆蟲黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊A.gambiae和埃及伊蚊Aedesaegypti等。眾所周知，昆蟲種類繁多，生態習性千差萬別。因此，源于模式昆蟲的相關研究報道很難泛化到一些重要的農林害蟲。目前已發現許多重要的農林害蟲的腸道中都棲息有豐富的細菌群落。和哺乳動物等模式生物類似，維持健康的腸道菌群穩態對于害蟲的正常生長發育至關重要(Muhammadetal., 2017, 2019a, 2019b; Hebinezaetal., 2019)。例如，腸道菌群對昆蟲的生長發育、營養代謝、抗藥性的產生、免疫防御與器官穩態維持、配偶選擇、交配競爭力和社會行為等眾多生理過程都有重要的影響作用(Chengetal., 2017; Chenetal., 2019; Wangetal., 2020)。因此，腸道菌群被認為是宿主體內的一個“超級器官” (O′Hara and Shanahan, 2006)。越來越多的研究證實腸道菌群穩態的變化會導致昆蟲發育延緩、壽命縮短和慢性炎癥等疾病的產生(Shinetal., 2011; Guoetal., 2014; Muhammadetal., 2017, 2019a, 2019b; Iatsenkoetal., 2018; Mottaetal., 2018)。因此，維持腸道菌群的穩態對宿主的健康生存至關重要。然而，關于害蟲如何維持和調控其腸道菌群穩態的免疫機理知之甚少。

紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus是我國的一種高風險性入侵害蟲，主要危害棕櫚科植物，還能危害甘蔗等農作物(鞠瑞亭等, 2006; Shietal., 2014)。該害蟲的腸道中棲居著主要由腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、蟲原體科(Entomoplasmataceae)和鏈球菌科(Streptococcaceae)4個科所構成的細菌群落，其中一些細菌具有降解纖維素的能力而且蘊含著大量編碼降解植物纖維素和淀粉等酶的功能基因(Jiaetal., 2013; Muhammadetal., 2017)。當腸道菌群的組成結構被改變或被徹底清除后，紅棕象甲的營養代謝受到顯著影響，免疫活性也被明顯降低，這說明腸道菌群在該害蟲的營養代謝和免疫防御等過程中扮演重要角色(Muhammadetal., 2017, 2019a, 2019b; Hebinezaetal., 2019)。與其他病原細菌一樣，絕大多數腸道細菌都會代謝釋放肽聚糖(peptidoglycan, PGN)到宿主腸腔內(Chu and Mazmanian, 2013)，而肽聚糖正是昆蟲識別“異己”進而激活其免疫系統的一種重要抗原物質(Royet and Dziarski, 2007)。因此，對于宿主昆蟲來說，如何科學地管理來自腸道菌群的肽聚糖而避免腸道免疫的過度激活來維持健康的腸道菌群穩態是一個重要挑戰。在昆蟲體內，肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)識別肽聚糖是激活其免疫系統的關鍵環節(Royetetal., 2011; 楊青泰等, 2018)。源于腸道菌群的肽聚糖可以穿透腸壁進入血淋巴進而影響宿主發育并增強宿主的免疫能力(Round and Mazmanian, 2009)，而且宿主的Toll-like免疫識別受體參與介導腸道菌群提高宿主適合度的生理過程(Kubinak and Round, 2012)。我們的前期調研發現，紅棕象甲具有一個編碼位于細胞質內的PGRP的功能基因RfPGRP-L2，而且該基因的編碼蛋白可能在該害蟲與其腸道菌群的互作過程中扮演關鍵角色。在本研究中，綜合運用RNAi、RT-qPCR、重組蛋白原核表達和基于細菌16S rRNA的高通量測序等多種手段解析了胞質型肽聚糖識別蛋白RfPGRP-L2的組織表達譜、免疫功能特征及其在該害蟲腸道菌群穩態調控和維持中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

紅棕象甲的實驗室種群飼養在人工氣候培養箱中(DRX-260，寧波賽福實驗儀器有限公司)。雌雄成蟲配對飼養在圓柱狀透明塑料盒(直徑7 cm，高10 cm)中，盒蓋上有紗布遮擋的孔以保證空氣流通。成蟲的飼養條件為溫度27±1℃、相對濕度75%±5%和光周期12L∶12D，用切片的新鮮甘蔗喂食，每4～5 d換一次甘蔗。在甘蔗片更換的過程中，小心剖開舊甘蔗片，用毛筆輕輕挑出其中的蟲卵，并置于含有潤濕濾紙的玻璃培養皿(直徑7 cm)中，然后將培養皿放入人工培養箱中待卵孵化。初孵幼蟲逐條挑出并轉移至含有新鮮甘蔗片的潔凈培養皿飼養，每皿僅放1頭幼蟲，每4～5 d更換一次甘蔗，幼蟲的飼養條件為溫度27±1℃、相對濕度75%±5%和光周期0L∶24D。幼蟲化蛹后，取出甘蔗片后加入一些干凈潮濕的甘蔗渣，待其羽化成成蟲。其中的部分4齡幼蟲用于后續的試驗處理。

1.2 紅棕象甲RfPGRP-L2的序列分析

利用ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和ExPASy-Translate Tool(https:∥web.expasy.org/translate/)分別預測RfPGRP-L2的開放閱讀框和其編碼的氨基酸序列，隨后采用在線分析工具SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)的一般模式(normal mode)預測RfPGRP-L2所含有的保守結構域，使用軟件MEGA 5.0中的最大似然法進行RfPGRP-L2與其他同源蛋白的系統進化分析。

1.3 紅棕象甲RfPGRP-L2的組織表達譜分析

隨機選取健康的紅棕象甲4齡幼蟲解剖獲取不同組織(頭、脂肪體、表皮、前腸、中-后腸和血淋巴)，每種組織設3個生物學重復，每個生物學重復含3頭試蟲。然后參照Dawadi等(2018)描述的方法步驟采用TRIzol法(ThermoFisher Scientific, 美國)從組織中提取總RNA。用微量分光光度計NanoDrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測所獲總RNA的RNA濃度、純度及完整性，隨后將符合要求的樣品保存在-80℃備用，利用Verso cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher Scientific, 美國)合成cDNA。根據Dawadi等(2018)的報道，利用在線引物設計軟件primer 3.0(http:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計RT-qPCR引物(表1)。采用FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Cat.No.04913850001)試劑盒在ABI 7500熒光定量PCR儀(Life Technology, 美國)上進行RT-qPCR，反應總體系(20 μL): 上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL, cDNA模板1 μL, Super Mix10 μL, 滅菌的去離子水8.4 μL。RT-qPCR程序: 95℃預變性10 min; 95℃變性15 s, 61℃退火延伸1 min, 40個循環。以紅棕象甲的Rfβ-actin基因為內參(Dawadietal., 2018)，采用2-ΔΔCt方法進行相對表達量的計算。

1.4 細菌感染對紅棕象甲腸道和脂肪體中RfPGRP-L2表達量的影響

為明確對細菌感染的響應特征，利用大腸桿菌EscherichiacoliDH5α和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus經注射(注射1 μL OD600=1.6的菌液)和喂食(取食涂抹了1 mL OD600=1.6的菌液的甘蔗薄片)兩種不同的方式分別感染紅棕象甲的4齡幼蟲，在感染后的6, 12和24 h解剖獲取腸道和脂肪體并提取總RNA。每個處理設3個生物學重復，每個重復含3頭試蟲。每個處理取1 μg總RNA用Verso cDNA Synthesis Kit(Thermo, AB1453B)反轉錄試劑盒制備RT-qPCR的cDNA模板。引物序列見表1，RT-qPCR反應體系和反應程序同1.3節，采用2-ΔΔCt方法進行相對表達量的計算。

1.5 紅棕象甲RfPGRP-L2的原核表達、純化與體外功能分析

基于PAS(PCR-based accurate synthesis)方法設計引物，并在引物的兩端各設計保護性堿基(表1)，以1.3節中的cDNA為模板，用高保真酶Taq-LA(大連寶生物工程有限公司)擴增并將其克隆連接至表達載體pET-32a上，構建表達質粒pET-32a-RfPGRP-L2并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，測序比對選擇正確的陽性克隆用于后續的誘導表達試驗(Dawadietal., 2018)。使用AXYGEN的質粒小提試劑盒提取表達質粒pET-32a-RfPGRP-L2并轉化至大腸桿菌Arctic ExpressTM感受態細胞(南京鐘鼎生物技術有限公司)中，接入含有50 μg/mL Amp的LB培養基中于37℃下培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20℃ 220 r/min振搖過夜，誘導融合蛋白表達。室溫下4 000 r/min離心10 min富集菌體，用PBS重懸并再次富集菌體后用細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl, 含1 mmol/L PMSF,細菌專用蛋白酶抑制劑混合物，pH 8.0)重新懸浮，于冰上進行超聲破碎20 min，將超聲破碎的細胞裂解液于4℃ 10 000 r/min離心20 min，收集沉淀。包涵體經過變復性的方式，重溶目標蛋白，通過Ni柱親和純化獲得目標蛋白，使用12% SDS-polyacrylamide gels (Bio-Rad)進行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍染色，結合Western blotting進行重組蛋白質量檢測(楊青泰等, 2018)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

參照Dawadi等(2018)制備大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌的懸浮液，進行重組蛋白RfPGRP-L2體外功能分析試驗。RfPGRP-L2的細菌凝集反應體系總體積為30 μL，包括5 μL細菌懸浮液和25 μL重組蛋白RfPGRP-L2(含或不含Zn2+，對照組用Tris-HCl緩沖液替代重組蛋白RfPGRP-L2)組成，混勻后于25℃水浴中孵育1 h，隨后將樣品制成玻片在Nikon ECLIPSE NI顯微鏡下進行觀察并拍照。RfPGRP-L2的抑菌活性反應體系為30 μL，反應體系與細菌凝集反應體系相同，混勻并離心，于25℃水浴中孵育5 h后，在超凈工作臺中向每管樣品中加入1 mL LB培養基，于37℃ 200 r/min過夜培養；在96孔板中加入上述培養物樣品，每孔100 μL，利用酶標儀SpectraMax(Molecular Devices Corp., 美國)測量菌液的OD600值。每個處理和對照設3個平行實驗。

1.6 RfPGRP-L2的RNAi

根據1.2節獲得的RfPGRP-L2全長序列，使用在線軟件E-RNAi (https:∥www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/idseq.php)設計并評估篩選最佳引物(表1)，利用MEGAscript? RNAi試劑盒(ThermoFisher Scientific, 美國)合成靶向該基因和EGFP的dsRNA，其中用于合成dsEGFP的引物序列引自王興紅(2018)(表1)。用無菌水清洗蟲體，并將其放于冰上進行冷凍麻醉處理3 min，然后用10 μL Hamilton注射器(WPI Corp., 美國)給每頭4齡試蟲從腹部的節間膜注射2 μL dsRNA(500 ng/μL)，對照組試蟲注射等量的dsEGFP作為參照。注射處理的試蟲放回人工氣候箱內進行飼養，48 h后解剖收集腸道和脂肪體并提取總RNA，利用表1中的特異性引物進行RT-qPCR檢測基靶因的沉默效率和該基因沉默對4個抗菌肽基因RfColeopericin,RfAtacin,RfCecropin和RfDefensin表達的影響，總RNA提取方法、RT-qPCR反應體系和反應條件同1.3節。每個處理設4個生物學重復，每個重復含3頭試蟲。

1.7 RNAi干擾RfPGRP-L2后紅棕象甲對細菌感染的響應檢測

根據Dawadi等(2018)的方法，注射dsRNA后的幼蟲置于正常飼養條件下飼養45 h后，注射2 μL EGFP標記的大腸桿菌DH5α菌液(OD600=2.0)于4齡幼蟲體腔內，3 h后在超凈工作臺中每頭幼蟲抽取100 μL血淋巴置于含有3 μL 5 mmol/L苯基硫脲(phenylthiourea, PTU)溶液的無菌EP管中，用無菌PBS進行梯度稀釋，在稀釋的過程中用移液槍抽打使之充分混勻，隨后取稀釋液100 μL均勻涂布于含AMP的LB平板，LB平板倒置放于37℃的恒溫培養箱中培養過夜，次日在Nikon ECLIPSE NI顯微鏡下統計每個平板上的細菌菌落數并拍照記錄，分析RfPGRP-L2沉默對紅棕象甲的血淋巴清除感染細菌能力的影響。每個處理設3個生物學重復，每個重復含3頭試蟲。

注射RfPGRP-L2的dsRNA后將4齡幼蟲放回培養箱正常飼養，12 h后對幼蟲進行饑餓處理12 h后喂食含有EGFP標記的大腸桿菌DH5α菌液(OD600=2.0)的新鮮甘蔗片24 h后，解剖提取腸道并放入含有1 mL無菌PBS的滅菌勻漿器中，充分研磨后取100 μL腸道勻漿液均勻涂布在含AMP的LB平板上，LB平板的培養條件和菌落計數方法同上，分析RfPGRP-L2沉默對紅棕象甲的腸道清除感染細菌能力的影響。每個處理設4個生物學重復，每個重復含3頭試蟲。

1.8 RNAi干擾RfPGRP-L2后健康紅棕象甲4齡幼蟲腸道菌群結構組成檢測

注射RfPGRP-L2的dsRNA 48 h后，參照Muhammad等(2017)的描述方法，先用75%酒精清洗蟲體表面90 s，接著用無菌水淋洗蟲體3次，隨后在超凈工作臺中解剖獲取腸道并迅速放入事先盛有1 mL無菌PBS的潔凈EP管中，立即放入液氮中迅速冷凍后置于-80℃中保存，利用DNeasy Blood & Tissue試劑盒(Qiagen, 德國)提取腸道細菌總DNA，用NanoDrop 2000(ThermoFisher Scientific,美國)和1%凝膠電泳分別檢測所提DNA的濃度和質量。每個處理設3個生物學重復，每個生物學重復含3頭幼蟲。以利用DNeasy Blood & Tissue試劑盒提取的腸道細菌總DNA作為模板，用帶有barcode的特異性引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)擴增細菌16S rRNA的V3+V4區，PCR反應體系: 0.2 μmol/L引物, Phusion? PCR預混液(New England Biolabs, 美國)15 μL, 腸道菌群總DNA模板10 ng，最后用滅菌的去離子水補足至30 μL。PCR反應程序: 98℃預變性1 min; 98℃變性10 s, 50℃退火30 s, 72℃退火延伸60 s, 30個循環; 72℃最后延伸5 min。技術重復3次，將PCR產物切膠回收，然后用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的PCR擴增產物等量混合并連接測序接頭、構建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機測序。參照Muhammad等(2017)和Dawadi等(2018)的數據分析流程，利用軟件工具Quantitative Insight into Microbial Ecology (QIIME)(V17.0, http:∥qiime.org/index.html)和Uprase(V7.0.1001，http:∥drive5.com/uprase)將測序獲得的raw reads進行過濾、拼接組裝和再過濾，保證利用最有效的數據聚類成可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)；獲得OTU后，利用QIIME軟件(17.0)比較分析干擾RfPGRP-L2對不同處理組間樣品腸道菌群的物種豐富度(Chao1指數和Ace指數)、群落多樣性(Shannon-Wiener指數和Simpson指數)和不同類群相對豐度的影響。

1.9 數據分析

采用單因素方差分析(ANOVA)檢測RfPGRP-L2在不同組織中的表達量差異、細菌感染對其在腸道和脂肪體中表達量的影響以及重組蛋白RfPGRP-L2對細菌生長的影響。采用t檢驗分析RNAi效率以及RNAi對抗菌肽表達量、細菌清除效率、腸道可培養細菌菌落數和腸道菌群多樣性的影響。所有統計分析使用SPSS 21.0軟件完成，利用Sigmaplot 12.0軟件制圖片。

2 結果

2.1 紅棕象甲RfPGRP-L2的序列特征

RfPGRP-L2(GenBank登錄號: MT830864)的cDNA序列全長為1 140 bp，其ORF長897 bp，編碼一個由298個氨基酸組成的多肽。該多肽無信號肽和跨膜結構域，是一種胞質型肽聚糖識別蛋白。其中的第121-264位氨基酸構成一個保守的PGRP結構域，RfPGRP-L2僅有第152位、第260位的組氨酸(H)和第186位酪氨酸(Y) 3個保守的酰胺酶活性位點，而第266位的酪氨酸(T)和第268位的半胱氨酸(C)均被替換，這表明該蛋白不具有酰胺酶活性所必需的5個保守氨基酸位點(圖1)。系統發育分析發現，RfPGRP-L2與赤擬谷盜Triboliumcastaneum和黃粉蟲Tenebriomolitor的PGRP-LE聚為一小支，與黑腹果蠅D.melanogaster和騷擾阿蚊Armigeressubalbatus的PGRP-LE聚為一個大支(圖2)，表明RfPGRP-L2是黑腹果蠅PGRP-LE的直系同源蛋白。有趣的是，該RfPGRP-L2具有一個cRHIM基序——VRIG，該基序是形成功能性淀粉樣蛋白進而激活NF-кB信號途徑所必需的保守結構域(Kleinoetal., 2017)，這暗示RfPGRP-L2可能作為一種識別細菌肽聚糖的免疫識別受體參與調控紅棕象甲免疫反應的應答。

圖1 紅棕象甲RfPGRP-L2核苷酸和推導的氨基酸序列分析Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of RfPGRP-L2 of Rhynchophorus ferrugineus下劃線表示PGRP保守結構域；灰色底紋表示Ami_2結構域；黑色方框表示保守的酰胺酶活性位點；圓圈表示突變的酰胺酶活性位點；紅色方框表示RHIM基序。The PGRP domain is underlined. Gray background represents the Ami_2 domain. The black boxes represent the conserved amidase activity sites. Circles represent the mutant amidase activity sites. The red box represents the RHIM motif.

圖2 最大似然法構建的基于氨基酸序列的紅棕象甲RfPGRP-L2與其他昆蟲PGRP蛋白的系統進化發育樹(1 000次重復)Fig. 2 Phylogenetic tree of RfPGRP-L2 of Rhynchophorus ferrugineus with PGRP proteins from other insect species constructedby maximum likelihood method based on amino acid sequence (1 000 replicates)PGRP蛋白來源物種和GenBank登錄號Origin species of PGRP proteins and their GenBank accession numbers: AsPGRP-LE: 騷擾阿蚊Armigeres subalbatus (AEX31482.1); CqPGRP-LC: 致倦庫蚊Culex quinquefasciatus (XP_001842237.1); DmPGRP-LE: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_573078.1); TcPGRP-LE: 赤擬谷盜Tribolium castaneum (XP_968926.1); TmPGRP-LE: 黃粉蟲Tenebrio molitor (HF935084.1); AaPGRP-LB: 埃及伊蚊Aedes aegypti (DQ023277.1); DmPGRP-LB: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (AAG23731.1); BtPGRP-LB: 歐洲熊蜂Bombus terrestris (XP_003400160.1); PrPGRP-LF: 菜粉蝶Pieris rapae (XP_022121530.1).

2.2 紅棕象甲RfPGRP-L2的組織表達譜

RT-qPCR檢測發現，RfPGRP-L2在紅棕象甲4齡幼蟲的血淋巴、前腸、中-后腸、頭、脂肪體、表皮各組織中均有表達，而且在不同組織中的表達量存在顯著差異(ANOVA:F5, 12=11.884,P<0.01)(圖3)。其中，該基因在血淋巴中的表達量顯著高于在中-后腸、脂肪體等其他組織，其中在前腸、中-后腸、頭和脂肪體中的表達水平沒有顯著性差異(P>0.05)，說明RfPGRP-L2可能參與介導紅棕象甲體內相關的免疫反應。

圖3 RfPGRP-L2在健康紅棕象甲4齡幼蟲不同組織中的相對表達量Fig. 3 Relative expression levels of RfPGRP-L2 indifferent tissues of the healthy 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus圖中數據為平均值±標準差；柱上不同字母表示不同組織間基因表達量差異顯著(P<0.05, LSD多重比較檢驗)。Data in the figure are mean±SD. Different letters above bars represent significant difference in the gene expression level (P<0.05, LSD multiple comparison test). 圖8同The same for Fig. 8.

2.3 細菌感染對紅棕象甲腸道和脂肪體中RfPGRP-L2表達量的影響

比較發現，RfPGRP-L2對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌的響應更迅速，在被感染6 h后其表達量就顯著上調，而該基因的表達量在革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌感染12 h后才出現明顯上調(圖4)。在腸道中，注射感染金黃色葡萄球菌12 h后，RfPGRP-L2的表達量顯著高于注射大腸桿菌組和對照組(ANOVA:F2, 6=16.46,P<0.01)(圖4: A)；而注射感染大腸桿菌6, 12和24 h后，其表達量在腸道中均沒有顯著變化，表明金黃色葡萄球菌的注射感染會影響腸道中RfPGRP-L2表達量的變化。注射感染金黃色葡萄球菌12 h后，脂肪體中RfPGRP-L2的表達量顯著增加(ANOVA:F2, 6=6.61,P<0.05)(圖4: B)。喂食感染大腸桿菌6 h后，腸道中RfPGRP-L2的表達量顯著地高于喂食金黃色葡萄球菌組和對照組(ANOVA:F2, 6=16.99,P<0.01)(圖5: A)，而且喂食金黃色葡萄球菌不能明顯地誘導腸道中RfPGRP-L2的表達量上調。喂食感染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均沒有明顯地影響該基因在脂肪體中的表達量(圖5: B)。以上結果表明，RfPGRP-L2參與調控紅棕象甲對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌的腸道免疫反應。

圖4 不同細菌注射感染后紅棕象甲4齡幼蟲腸道(A)和脂肪體(B)中RfPGRP-L2表達量的變化Fig. 4 Changes in expression level of RfPGRP-L2 in the gut (A) and fat body (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus after injection challenge with different bacteria各組織分別注射1 μL無菌磷酸鹽緩沖液(對照)、大腸桿菌菌液(OD600=1.6)和金黃色葡萄球菌(OD600=1.6)菌液。圖中數據為平均值±標準差；柱上大寫字母表示同一時間點不同處理間的基因表達量差異顯著，小寫字母表示同一處理不同時間點間基因表達量差異顯著(P<0.05, LSD多重比較檢驗)。Each tissue was injected with 1 μL sterile phosphate buffered saline (control), Escherichia coli suspension (OD600=1.6) and Staphylococcus aureus suspension (OD600=1.6), respectively. Data in the figure are mean±SD. Capital letters above bars represent significant difference in the gene expression level between different treatments at the same time point, and the lowercase letters represent significant difference in the gene expression level between different time points in the same treatment (P<0.05, LSD multiple comparison test). 圖5同The same for Fig. 5.

圖5 不同細菌喂食感染后紅棕象甲4齡幼蟲腸道(A)和脂肪體(B)中RfPGRP-L2表達量的變化Fig. 5 Changes in expression levels of RfPGRP-L2 in the gut (A) and fat body (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus after oral challenge with different bacteria幼蟲取食涂抹了1 mL OD600=1.6的菌液的甘蔗薄片Larvae were fed with the sugarcane slices smeared with 1 mL bacterial suspension with the OD600 value of 1.6.

2.4 重組蛋白RfPGRP-L2的細菌凝集和抑菌活性

重組蛋白RfPGRP-L2在上清液和沉淀中均有表達，而且沉淀中的表達量明顯高于上清液，表明靶蛋白主要以包涵體形式表達。經變復性實驗純化回收和Western blot檢測證實，純化所得RfPGRP-L2的分子量大小符合預期且條帶單一，可用于后續功能分析實驗(圖6)。在沒有RfPGRP-L2的情況下，反應體系中的細菌細胞在載玻片上呈現均勻分布的狀態；當RfPGRP-L2與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌液在25℃ 孵育1 h后， 兩種菌液體系都已發生細菌細胞凝集的現象，而且Zn2+的添加對凝集現象沒有明顯的影響(圖7)。結果表明RfPGRP-L2能夠識別結合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌并引起凝集反應。抑菌測試證實， RfPGRP-L2對大腸桿菌(ANOVA:F3,8=2.92,P=0.10)(圖8: A)和金黃色葡萄球菌(ANOVA:F3,8=0.73,P=0.56)(圖8: B)的生長都沒有顯著影響。

圖6 重組蛋白RfPGRP-L2純化后Western blot檢測Fig. 6 Western blot verification of the purifiedrecombinant protein RfPGRP-L2M: 蛋白質分子量標準Protein molecular weight marker.

2.5 RfPGRP-L2的干擾效率

注射dsRNA 48 h后，RfPGRP-L2在紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體(t6=3.10,P<0.05)和腸道(t6=2.59,P<0.05)中的表達量都顯著地低于對照組 (圖9)， 沉默效率分別為66.1%和53.3%， 表明注射dsRfPGRP-L2能夠顯著地降低RfPGRP-L2在該害蟲體內的表達水平。

圖7 重組蛋白RfPGRP-L2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的凝集作用Fig. 7 Agglutination of Escherichia coli and Staphylococcus aureus by the recombinant RfPGRP-L2紅色箭頭表示觀察到的細菌凝集現象；加號表示反應體系中添加重組蛋白RfPGRP-L2或Zn2+，減號表示反應體系中沒有添加重組蛋白RfPGRP-L2或Zn2+。The red arrow represents the bacterial agglutination observed. The plus symbol represents the addition of the recombinant protein RfPGRP-L2 or Zn2+ in the reaction system, while the minus symbol represents the absence of the recombinant protein RfPGRP-L2 or Zn2+ in the assays.

圖8 重組蛋白RfPGRP-L2對大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)生長的影響Fig. 8 Effect of the recombinant protein RfPGRP-L2 on the growth of Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)Tris: 只添加Tris鹽酸緩沖液Only Tris-HCl buffer was added; Tris+Zn2+: 添加了Tris鹽酸緩沖液和Zn2+ Addition of Tris-HCl buffer and Zn2+; RfPGRP-L2: 只添加了重組表達蛋白Only the recombinant protein was added; RfPGRP-L2+Zn2+: 同時添加了重組表達蛋白和Zn2+ Addition of recombinant protein and Zn2+.

圖9 紅棕象甲4齡幼蟲腸道和脂肪體中RfPGRP-L2的RNAi干擾效率Fig. 9 RNAi efficiency of RfPGRP-L2 in the gutand fat body of the 4th instar larvae ofRhynchophorus ferrugineus注射dsEGFP為對照組；圖中數據為平均值±標準差；柱上星號表示兩組之間基因表達量有顯著性差異(P<0.05, t檢驗)。Injection of dsEGFP as the control group. Data in the figure are mean±SD. Asterisk above bars indicates significant difference in the gene expression level between the two groups (P<0.05, t-test). 圖10-12同The same for Figs. 10-12.

2.6 干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲清除感染大腸桿菌能力的影響

RfPGRP-L2沉默組試蟲血淋巴中的綠色熒光蛋白標記的大腸桿菌菌落數為4 025.00±2 345.74 CFU/mL，是對照組的10倍(t6=3.00,P<0.05)(圖10: A)，表明RfPGRP-L2的沉默顯著降低了血淋巴對感染細菌的清除能力。脂肪體中RfCecropin的表達量顯著降低(t6=2.75,P<0.05)，而其他3個抗菌肽基因RfDefensin(t6=0.51,P=0.63),RfAttacin(t6=1.60,P=0.16)和RfColeoptericin(t6=2.15,P=0.075)的表達量沒有顯著變化(圖11: A)。腸道中綠色熒光蛋白標記大腸桿菌的菌落數顯著增加(t4=2.81,P<0.05)(圖10: B)，表明該害蟲對腸道中感染細菌的清除能力因RfPGRP-L2的沉默而被削弱。腸道中RfCecropin的表達量顯著下降(t6=2.78,P<0.05)(圖11: B)。上述結果證明RfPGRP-L2不僅參與紅棕象甲系統免疫的激活，還介導腸道內的免疫反應來清除所感染的非腸道細菌。

2.7 干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲腸道菌群結構組成的影響

圖10 大腸桿菌侵染RNAi干擾RfPGRP-L2后的紅棕象甲4齡幼蟲血淋巴(A)和腸道(B)中菌落數Fig. 10 Number of Escherichia coli colonies in the hemolymph (A) and gut (B) of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus after RNAi of RfPGRP-L2

圖11 RNAi干擾RfPGRP-L2后紅棕象甲4齡幼蟲脂肪體(A)和腸道(B)中抗菌肽基因的表達量變化Fig. 11 Changes in the expression levels of antimicrobial peptide genes in the fat body (A) and gut (B)of the 4th instar larvae of Rhynchophorus ferrugineus after RNAi of RfPGRP-L2

RfPGRP-L2被沉默后，腸道中可培養細菌的菌落數為7 733.33±1 950.21 CFU/mL，而對照組腸道中的可培養細菌菌落數為3 300.00±1 452.58 CFU/mL，前者顯著大于后者(t4=3.16,P<0.05)(圖12)，說明RfPGRP-L2的沉默會導致紅棕象甲幼蟲腸道菌群數量的明顯增加。RfPGRP-L2的干擾對菌群物種豐富度(Chao1指數:t6=-0.004,P=0.10; Ace指數:t6=0.34,P=0.75)(圖13: A)和群落多樣性(Shannon-Wiener指數:t6=-0.25,P=0.81; Simpson指數:t6=-0.11,P=0.92)(圖13: B)都沒有顯著的影響。但是一些腸道細菌的相對豐度因RfPGRP-L2的沉默而發生了改變。例如，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和軟壁菌門(Tenericutes)為腸道優勢菌(Muhammadetal., 2017)，但是RfPGRP-L2被干擾后，軟壁菌門的相對豐度增加了41.1%，厚壁菌門的相對豐度減少了67.9%(圖14: A)。在科水平上，RfPGRP-L2的干擾導致乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)細菌的相對豐度降低了60.9%，而蟲原體科(Entomoplasmataceae)和明串珠菌科(Leuconostocaceae)細菌的相對豐度分別增加了68.0%和91.8%(圖14: B)。這些數據表明RfPGRP-L2的沉默能夠造成紅棕象甲幼蟲腸道菌群的數量增加并改變腸道菌群的組成結構，說明RfPGRP-L2在紅棕象甲腸道菌群穩態的調控中具有重要作用。

圖12 RfPGRP-L2干擾后對紅棕象甲4齡幼蟲腸道中可培養細菌菌落數量的影響Fig. 12 Effect of RNAi of RfPGRP-L2 on the numberof culturable bacterial colonies in the gut of the 4thinstar larvae of Rhynchophorus ferrugineus

圖13 RNAi干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲腸道細菌物種豐富度(A)和群落多樣性(B)的影響Fig. 13 Effect of RNAi of RfPGRP-L2 on the species richness (A) and community diversity (B)of gut bacteria of the 4th instar larvae of Rhynchophorus ferrugineusChao: Chao1指數Chao1 index; Ace: Ace指數Ace index; Shannon: Shannon-Wiener指數Shannon-Wiener index; Simpson: Simpson指數Simpson index. 圖中數據為平均值±標準差。Data in the figure are mean±SD.

圖14 RNAi干擾RfPGRP-L2對紅棕象甲4齡幼蟲腸道菌群在門(A)和科(B)水平上組成的影響Fig. 14 Effect of RNAi of RfPGRP-L2 on the composition of gut bacteria of the 4th instar larvaeof Rhynchophorus ferrugineus at the levels of phylum (A) and family (B)

3 討論

本研究發現RfPGRP-L2編碼的多肽具有一個PGRP功能結構域(圖1)，但沒有信號肽和跨膜結構域，表明RfPGRP-L2的編碼蛋白是一種胞質型肽聚糖識別蛋白(Royetetal., 2011)?，F有證據表明具有酰胺酶活性的PGRP一般都有HYHTC 5個保守的氨基酸位點(Chenetal., 2014; Dawadietal., 2018)。但是RfPGRP-L2僅有其中的3個保守酰胺酶活性位點，而另外兩個位點均被替換，這暗示紅棕象甲的RfPGRP-L2可能不具有酰胺酶活性，從而無法像T7噬菌體溶菌酶和酰胺酶活性PGRPs能夠降解肽聚糖(Mellrothetal., 2003; Zaidman-Rémyetal., 2006; Dawadi etal., 2018)。然而有趣的是，我們發現RfPGRP-L2具有一個由VRIG這 4個氨基酸殘基所構成的RHIM基序。RHIM基序參與介導形成的功能性淀粉樣纖維(Amyloid fibril)為激活IMD免疫信號所必需(Aggarwaletal., 2008; Kleinoetal., 2017)。因此，RfPGRP-L2中的RHIM基序可能在將細菌識別的信號傳遞至細胞核內、激活相關的免疫信號通路并激發效應因子(如抗菌肽)的產生過程中扮演關鍵角色。此外，Pirk是NF-кB信號通路中的一個重要負調控因子(Kleinoetal., 2008)，可以通過PGRP-LC和-LE中的RHIM基序特異性地與Imd互作進而抑制功能性淀粉樣纖維的形成，從而阻礙IMD下游信號的轉導(Lhocineetal., 2008; Kleinoetal., 2017)。因此，該保守基序的存在暗示RfPGRP-L2可能是紅棕象甲相關免疫信號通路中的一個重要負調控作用靶標，以避免該害蟲體內免疫系統的過度激活從而維持健康的免疫穩態。

RT-qPCR檢測發現RfPGRP-L2在血淋巴、脂肪體和腸道等免疫相關組織中的表達豐度明顯高于其他組織(圖3)，這暗示RfPGRP-L2可能參與介導調控紅棕象甲的免疫反應(Dawadietal., 2018)。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的感染均能顯著誘導RfPGRP-L2的表達。Muhammad等(2019b)研究發現，腸道菌群能夠上調紅棕象甲的相關免疫基因并增強其免疫防御活性。這些證據說明部分對宿主無害的微生物能夠刺激宿主體內免疫基因的表達從而提高宿主對病原微生物的免疫力。另外，重組表達的RfPGRP-L2可以引起大腸桿菌和金黃色葡萄球菌發生凝集反應(圖7)，這說明RfPGRP-L2既可以識別含DAP型PGN的革蘭氏陰性細菌，也能識別含Lys型PGN的革蘭氏陽性細菌。細菌的喂食感染能夠使腸道中RfPGRP-L2的表達顯著上調(圖5: A)，而對脂肪體中的表達量無顯著影響(圖5: B)，這可能是由于脂肪體和腸道中可能存在不同的免疫調控機制(Tzouetal., 2000)。更為有趣的是，RfPGRP-L2被干擾后，紅棕象甲幼蟲的血淋巴和腸道清除綠色熒光蛋白標記的大腸桿菌的能力被顯著地抑制(圖10)，脂肪體中抗菌肽基因RfCecropin的表達量顯著低于對照組(圖11: A)。這些數據說明RfPGRP-L2干擾在一定程度上阻礙了該害蟲的系統免疫和腸道局部免疫的應答反應。另外，體外研究還證實重組蛋白RfPGRP-L2不能抑制細菌的生長(圖8)，說明紅棕象甲的RfPGRP-L2不具有酰胺酶活性，無法降解細菌PGN抑制細菌的生長。這可能是由于RfPGRP-L2不含有酰胺酶活性所必需的5個保守氨基酸位點所致(Chenetal., 2014; Dawadietal., 2018)。

我們的前期工作發現，相比Toll-like pathway而言，核轉錄因子RfRelish介導的IMD-like信號通路在紅棕象甲與其腸道菌群共生關系的維持中占主導地位，這可能是由于腸道菌群主要由革蘭氏陰性細菌所構成(Xiaoetal., 2019; Muhammadetal., 2020)。在本研究中，RfPGRP-L2的沉默造成了腸道中可培養細菌菌落數的顯著增加(圖12)，并且改變了其腸道菌群的組成結構(圖14)；而且腸道中RfCecropin的表達量也顯著低于對照組(圖11: B)。這表明RfPGRP-L2的沉默阻礙了腸上皮細胞對來自腸道菌群PGN的識別，進而影響了相關免疫信號通路的激活及抗菌肽的產生?？咕氖莿游镎{控其腸道微生物的一種關鍵免疫效應因子(Ryuetal., 2008)。因此，RfPGRP-L2沉默導致腸道免疫效應基因表達的降低削弱了該害蟲對其腸道菌群的調控，從而造成了腸道細菌數量的增加及其組成的改變。在前期研究中，我們發現紅棕象甲具有跨膜型、分泌型和胞質型3種不同類型的PGRP，其中兩個具有酰胺酶活性的肽聚糖識別蛋白RfPGRP-S1和RfPGRP-LB都能降解肽聚糖而避免腸道免疫的過度激活來調控該害蟲的腸道菌群穩態(Dawadietal., 2018; 王興紅, 2018)。然而，調控這些分泌型PGRP產生的機理還不清楚。例如，RfPGRP-L2是否與這些分泌型PGRP之間存在互作？它們之間的互作在該害蟲腸道菌群穩態的調控中扮演什么角色？這些問題還需要進一步的深入研究。