LY3023414靶向抑制PI3K/AKT/mTOR信號轉導誘導人皮膚基底細胞癌細胞凋亡

楊麗亞，劉彩玉

（恩施土家族苗族自治州中心醫院，湖北恩施445000）

非黑色素瘤皮膚癌（Nom-melanoma skin cancer） 是導致人類死亡的主要原因之一，包括鱗狀細胞癌和基底細胞癌[1-2]。根據統計調查發現，超過20%的人在一生中可能會患上皮膚癌，并且近十年來其發病率呈升高的趨勢[3]。目前，皮膚癌的標準治療方案包括手術、放療和化療，晚期皮膚癌患者預后并不理想[4]。因此，開發治療皮膚癌的新型高效藥物是很有意義的。

磷脂醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的哺乳動物靶點（PI3K/AKT/mTOR）級聯信號傳導是研究較多的致癌/抗癌途徑[5]。PI3K/AKT/mTOR途徑的過度激活在皮膚癌和其他腫瘤生物學行為中都有發現，包括細胞存活、增殖、遷移、細胞凋亡、腫瘤轉移、血管生成和轉化[6-7]。于是，PI3K/AKT/mTOR信號系統是治療及預防皮膚癌的一個潛在靶點，開發的一些PI3K/AKT/mTOR抑制劑已在臨床前或臨床腫瘤治療中進行了研究[8]。

最新研究開發出的一種新型的、有效的、口服生物可用的PI3K/mTOR雙向抑制劑（LY3023414），其還能阻斷AKT信號傳導[9]。本研究觀察LY3023414對體外培養的人皮膚基底細胞癌細胞生長的影響及其作用機制。

1 材料及方法

1.1 一般資料

1.1.1 主要試劑 LY3023414購買于北京AdooQ Bioscience公司，其他PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑（納巴霉素、OSI-027、MK-2206和渥曼青霉素）購買于上海 Selleck公司，Annexin V-FITC/PI和CCK8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所，兔anti-Cleaved-caspase-3、兔 anti-CleavedPARP、兔 antip-P85（Y458）、兔 anti-P85、兔 anti-p-AKT（S473 and T308）、兔 anti-AKT、兔 anti-p-S6K（T389）、兔anti-S6K和兔anti-β-actin購自英國Abcam公司，Caspase-glot-3/9活性測定試劑盒購買于美國Promega公司，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）單鏈DNA（ss DNA）試劑盒購買于武漢華美生物有限公司。

1.1.2 主要儀器 CY78-5型單人超凈臺（蘇州華新空調凈化有限公司）；細胞培養箱（上海醫用分析儀器廠）；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀（DX540，美國）；SDS-PAGE凝膠電泳儀（型號DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）；成像系統（BIO-RAD，美國），FACS-Calibur流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.1.3 細胞培養及藥物干預 TE354T細胞、原代Pri can-1細胞、原代Pri can-2細胞、人皮膚黑素細胞、皮膚角質形成細胞和皮膚成纖維細胞由武漢巴菲爾生物有限公司提供，且均采用含10%胎牛血清的高糖培養基（DMEM）高糖培養液，培養箱條件設置為5% CO2、4℃恒溫，顯微鏡觀察細胞生長至90%左右時，便可開始傳代培養。LY3023414（5、10、50、100、200nmol/L）分別處理人皮膚基底細胞（TE354T）細胞24h、48h及72h后，再進行后續實驗。100 nmol/L的LY3023414處理原代Pri can-1細胞、原代Pri can-2細胞、人皮膚黑素細胞、皮膚角質形成細胞和皮膚成纖維細胞48 h后，再進行后續實驗。

1.2 方法

1.2.1 CCK8實驗 將對數期細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養過夜，經LY3023414處理后，棄去舊培養液，每孔加入100μL含10μL的CCK8試劑的DMEM培養液，放入培養箱中繼續孵育1.5h，在酶標儀450 nm波長處檢測細胞吸光度OD值，并計算細胞相對存活率。計算公式如下：細胞相對存活率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.2 Caspase活性實驗 將對數期細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養過夜，然后經LY3023414處理細胞48 h后，Caspase-glot-3/9活性測定試劑盒檢測Caspase-3/9活性，采用酶標儀在405 nm處測定其吸光度值。

1.2.3 ssDNA凋亡ELISA 將對數期細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞，培養過夜，然后加入LY3023414處理細胞48 h后，收集細胞裂解，取上清液，ss DNA酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒分析裂解液中ss DNA水平，采用酶標儀在405nm處測定其吸光度值。

1.2.4 流式細胞術實驗 將對數期細胞接種于6孔板，每孔2×105個細胞，培養24h，然后加入100nmol/L的LY3023414處理細胞48 h后，棄去舊培養液，消化收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細胞（按照試劑盒操作說明書進行），最后用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況。

1.2.5 免疫印跡實驗 收集各組細胞，PBS清洗細胞2次，每孔加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細胞裂解液，4℃條件下12000r/min（離心半徑10 cm）離心12 min，收集上清。二辛喹酸（BCA）法檢測了上清中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg進行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后在恒流275 mA條件下電轉70 min，5%脫脂牛奶封閉1 h后，將目的條帶放入對應的一抗溶液（稀釋比1∶1000）中，4℃搖床孵育過夜。洗膜緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次，再把條帶放入盛二抗（稀釋比 1∶3 000）的平皿中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入4mL的增強型化學發光顯影液（ECL）顯色3 min，凝膠成像系統曝光。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LY3023414抑制TE354T細胞增殖 采用不同濃度 LY3023414（5～200 nmol/L）分別處理 TE354T細胞24 h、48 h及72 h后，結果提示LY3023414處理細胞48 h后對TE354T細胞的增殖活性有明顯的抑制作用，且呈現出濃度和時間依賴性（P<0.05）。LY3023414干預TE354T細胞48 h后，其半數抑制率（IC50）大約在100 nmol/L，見圖1A。細胞克隆實驗發現，LY3023414呈濃度依賴性的減少TE354T細胞克隆數（P<0.05），見圖1B。BrdU ELISA實驗結果提示，LY3023414呈濃度依賴性的降低TE354T細胞的吸光度（P<0.05），見圖1C。細胞周期考察發現，LY3023414處理TE354T細胞48 h，G0-G1期細胞數明顯增多，而S期和G2-M期細胞數明顯減少（P<0.05），見圖 1D。

實驗進一步采用原代人皮膚基底細胞癌細胞（Prican-1和Prican-2）為研究對象，發現100 nmol/L的LY3023414處理Pri can-1和Pri can-2細胞48 h后，能夠明顯抑制細胞的增殖能力（P<0.05），見圖1E。另外，采用100 nmol/L的LY3023414處理皮膚黑素細胞、皮膚角質形成細胞和皮膚成纖維細胞48 h后，發現其對上述3種細胞增殖活性沒有明顯影響（P<0.05），見圖 1F。

圖1 LY3023414降低TE354T細胞增殖活性

2.2 LY3023414誘導TE354T細胞凋亡 進一步觀察LY3023414對TE354T細胞凋亡的影響，結果顯示LY3023414呈劑量依賴性的誘導TE354T細胞中凋亡相關蛋白Caspase-9和Caspase-3的活性，見圖2A；同時LY3023414呈劑量依賴性的誘導促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表達，見圖2B。進一步對細胞凋亡標志物單鏈DNA（ss DAN）的水平檢測，提示LY3023414呈劑量依賴性的增高ss DAN的含量，見圖2C。實驗還采用流式細胞術實驗分析LY3023414對TE354T細胞凋亡的影響，發現100 nmol/L的LY3023414處理細胞48 h后，能明顯誘導細胞凋亡的發生，見圖2D、E。

100 nmol/L的LY3023414處理Pri can-1和Pri can-2細胞48h后，能夠明顯誘導細胞凋亡（P<0.05），見圖2F。另外，采用100 nmol/L的LY3023414處理皮膚黑素細胞、皮膚角質形成細胞和皮膚成纖維細胞48 h后，發現其對上述3種細胞中ss DAN水平沒有明顯影響（P<0.05），見圖2G。

圖2 LY3023414誘導TE354T細胞凋亡

2.3 LY3023414對PI3K/AKT/mTOR信號轉導的影響 LY3023414是PI3K/AKT/mTOR信號通路潛在的、新的抑制劑，于是進一步觀察PI3K/AKT/mTOR信號傳導活性。100 nmol/L的LY3023414處理TE354T和Pri can-1細胞48 h后，PI3K/AKT/mTOR信號通路靶蛋白 P85（Y458）、AKT（S473 和 T308）和S6K（T389）的磷酸化水平均降低，而 P85、AKT1/2和S6K1表達水平沒有發生變化，見圖3A、B。然而，皮膚成纖維細胞中P85、AKT1/2和S6K1表達水平相對較低，而且 LY3023414 對 P85（Y458）、AKT（S473 和T308）和S6K（T389）的磷酸化水平也沒有明顯影響，見圖3C。

圖3 LY3023414對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

2.4 不同PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑對TE354T細胞增殖的影響 實驗進一步比較LY3023414（LY）和其他PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑，包括雷帕霉素（Rap）、mTOR 激酶抑制劑 OSI-027（OSI）、AKT特異性抑制劑MK-2206（MK）和渥曼青霉素（WT），抗TE354T細胞增殖的活性。LY3023414相比于同濃度的其他抑制劑更能明顯抑制TE354T細胞的增殖活性，見圖4A。同樣的，LY3023414相比于同濃度的其他抑制劑更能明顯增高TE354T細胞凋亡標志物ss DNA的水平，見圖4B。

圖4 PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑降低TE354T細胞增殖活性

3 討論

臨床研究表明，人皮膚鱗狀細胞癌和基底細胞癌組織中PI3K/AKT信號通路過度激活，提示該信號系統是導致皮膚癌發病的機制[10-11]。已有研究證實，人皮膚鱗狀細胞癌和基底細胞癌中p-AKT免疫熒光結果為陽性，并且p-AKT表達水平在鱗狀細胞癌中相對于基底細胞癌更高[1-2]。因此，PI3K/AKT信號抑制是治療皮膚癌的一個潛在靶點。本文研究中，實驗證實了新的PI3K/AKT/mTOR抑制劑LY3023414對TE354T細胞系、原代人皮膚基底細胞癌細胞有不良反應。LY3023414誘導TE354T細胞停滯在G0/G1-S期，進而抑制細胞增殖。與此同時，LY3023414通過激活caspase-3/9活性誘導TE354T細胞凋亡。

mTOR位于PI3K/AKT/mTOR信號通路的中心位置，已發現至少2種mTOR復合體（mTORC1和mTORC2）[13]。本文研究發現PI3K抑制劑LY3023414對人皮膚基底細胞癌TE354T細胞的藥物毒性作用相比于mTORC1抑制劑納巴霉素、OSI和WT更強?？赡艿慕忉屖且种苿┘{巴霉素和OSI-027只能僅僅抑制mTOR介導的信號傳導，而LY3023414能阻斷整個PI3K/AKT/mTOR信號通路。更有趣的是，LY3023414素對TE354T細胞增殖的抑制作用也明顯優于WT，可能是由于LY3023414同時干擾了其他致癌信號傳導的活化，比如GSK-3β/CREB信號通路[15]。本文結果還提示LY3023414可以降低PI3K/AKT/mTOR 信號通路靶蛋白P85（Y458）、AKT（S473和 T308）和 S6K（T389）的磷酸化水平，進而誘導了TE354T細胞的早期和晚期凋亡，還降低了促凋亡蛋白Cleaved casapase-3和Cleaved PARP的表達，并且呈濃度依賴性的促使凋亡標志物ssDNA的水平。

綜上所述，LY3023414通過靶向抑制 PI3K/AKT/mTOR信號通路活化，降低了人皮膚基底細胞癌TE354T細胞的增殖活力，并誘導了其凋亡。研究結果為LY3023414臨床上治療人皮膚基底細胞癌提供合理的依據。