白細胞介素-33和皮膚鱗狀細胞癌的相關性研究

程賽，夏永華，張孟杰，張彩鳳，劉冬，胡華

（新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉453000）

皮膚鱗狀細胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是源于皮膚表皮的惡性腫瘤，好發于中老年。既往研究多認為基因突變、紫外線照射、人乳頭瘤病毒感染等均是CSCC發病的重要原因[1]，但近年來研究發現，炎性因子在CSCC的發病及其轉移中扮演了重要作用[2-3]。CSCC發病率較高，流行病學研究結果顯示，2000—2010年相對于1976—1984年，CSCC發病率增加了263%[4]，致死率約為3%～4%[5]。因此，明確炎性因子在CSCC發病機制中的作用顯得至關重要。白細胞介素（IL）-33屬于IL-1家族中的一種炎性因子，參與了多種炎癥性皮膚病如銀屑病[6]、系統性紅斑狼瘡[7]等發病機制，Chen等[8]研究結果顯示，頭頸部鱗狀細胞癌（SCC）癌組織中IL-33 mRNA及蛋白表達水平顯著升高，且與病情進展及不良預后密切相關。目前，國內關于CSCC患者血清中IL-33表達水平的相關研究報道較少，本研究通過檢測CSCC患者血清和皮損中IL-33蛋白表達水平，進一步明確CSCC和IL-33的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2018年1月—2019年8月于我院皮膚科就診且經病理確診的64例原發性CSCC患者作為CSCC組，其中男36例，女28例，平均年齡（57.15±13.02）歲。所有CSCC患者均排除合并結締組織病、其他臟器腫瘤及內臟腫瘤皮膚轉移等。另選取40例體檢中心健康體檢者作為對照組，其中男 21例，女 19例，平均年齡（56.25±11.52）歲。2組研究對象在年齡和性別上相比較，差異無統計學意義。上述所有研究對象均知情同意且簽署知情同意協議書，本研究經過我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 CSCC患者一般資料的收集 收集CSCC患者的性別、年齡、發病部位（暴露部位如頭面、頸部；非暴露部位如軀干、四肢等）、病程、腫瘤直徑、有無淋巴結轉移、腫瘤細胞分化程度、臨床分期等詳細信息。臨床分期評估采用美國癌癥協會非黑素瘤皮膚腫瘤淋巴結轉移（TNM）分期系統[9]，其中原位癌定義為0期；腫瘤直徑＜2 cm，無淋巴結和遠處轉移定義為Ⅰ期；腫瘤直徑2～5 cm，無淋巴結和遠處轉移定義為Ⅱ期；腫瘤細胞侵犯其他組織（骨、軟骨及骨骼肌等），但無淋巴結和遠處轉移；或無論腫瘤大小，只要存在淋巴結轉移均定義為Ⅲ期；無論腫瘤大小及有無淋巴結轉移，只要存在遠處轉移定義為Ⅳ期。

1.2.2 CSCC患者血清IL-33表達水平的檢測 于入院后抽取所有研究對象外周靜脈血3 mL于試管中，靜置5 min后離心，取上層血清保存到新的EP管中，放入-80℃冰箱中保存待測。血清IL-33表達水平采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法試劑盒進行檢測，ELISA試劑盒購買自上海江萊生物科技有限公司（貨號196508）。所有檢測操作步驟嚴格按照說明書進行操作。

1.2.3 CSCC組織中IL-33蛋白相對表達水平的檢測 取3例手術切除且經病理確診的CSCC患者的部分皮膚鱗癌組織及其癌旁組織，另取3例本科室色素痣行手術切除的周圍正常組織，生理鹽水清洗后置于EP管中，放入-80℃冰箱中保存。為減少性別和年齡等因素導致CSCC組織、癌旁組織及正常組織中IL-33蛋白相對表達水平的差異，2組患者性別均為男性，平均年齡分別為（60.14±10.22）歲和（59.14±13.14）歲，性別和年齡相比差異無統計學意義。取3組皮膚組織于潔凈研缽中，加入液氮并研磨成粉末，粉末移入EP管中并加入500 μL的RIPA裂解液，冰上孵育約30 min，在4℃下12 000 r/min（離心半徑4 cm）離心20 min，離心后的上清液移入新的EP管進行分裝，于-80℃冰箱中保存。配上層和下層膠并插入梳子，待膠凝固后加入5 μL蛋白樣品和Marker進行電泳，電泳結束后取出凝膠，剪相應大小的聚偏氟乙烯（PVDF）膜，加入電轉液中進行電轉，牛奶封閉，加入一抗 IL-33（1∶1 000）抗體和β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入二抗（1∶1 000）孵育 1 h，采用化學發光法檢測目的條帶的灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值比值作為蛋白表達水平。所有實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用頻數或百分比表示，采用卡方檢驗；多組間比較采用方差分析；CSCC患者血清中IL-33表達水平的影響因素采用Logistic回歸分析；采用受試者操作特征曲線（ROC）評估IL-33在診斷CSCC發生淋巴結轉移中的臨床效能，皮膚組織中IL-33蛋白相對表達水平采用Image J軟件進行定量測定，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSCC患者血清IL-33表達水平 CSCC組和對照組血清IL-33表達水平分別為（217.82±23.54）ng/mL 和（86.15±15.02）ng/mL，與對照組相比，CSCC組血清IL-33表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=31.557，P＜0.05）。

2.2 CSCC患者組織中IL-33蛋白相對表達水平 為進一步探討CSCC組癌組織中IL-33蛋白相對表達水平是否升高，Western blot結果顯示，CSCC組癌組織（1.12±0.13）中IL-33蛋白相對表達水平顯著高于癌旁組織（0.53±0.04）和正常皮膚組織（0.13±0.01），差異有統計學意義（t1=7.538；t2=13.177，P＜0.05）；癌旁組織中IL-33蛋白相對表達水平顯著高于正常皮膚組織，差異有統計學意義（t=16.803，P＜0.05）。見圖1。

圖1 CSCC癌組織、CSCC組癌旁組織及正常皮膚組織中IL-33蛋白相對表達水平的比較（n=3）

2.3 CSCC患者血清IL-33表達水平與臨床及病理特征的相關性 結果表明，CSCC患者病程越長、腫瘤直徑越大、TNM分期越高、組織學分級越低、存在淋巴結或遠處轉移，血清中IL-33表達水平越高。見表1。

表1 血清IL-33表達水平與CSCC臨床及病理特征的關系 （ng/mL，±s）

表1 血清IL-33表達水平與CSCC臨床及病理特征的關系 （ng/mL，±s）

臨床及病理特征參數 n I L-3 3 t/F P性別 -0.9 3 0 0.3 5 5男3 6 2 1 5.1 7±2 2.4 8女2 8 2 2 0.1 6±1 9.6 2年齡0.3 9 0 0.6 9 7＜5 0周歲 2 1 2 1 8.4 5±2 0.6 8≥5 0周歲 4 3 2 1 6.0 5±2 4.1 7病程-3.7 1 3 0.0 0 0＜1 年 3 6 2 0 6.4 8±1 9.6 2≥1年 2 8 2 2 6.4 4±2 3.3 6腫瘤直徑 4.8 5 6 0.0 0 0＜2 c m 2 4 2 0 5.1 3±1 7.4 2 2～5 c m 2 9 2 2 5.5 9±2 3.2 5≥5 c m 1 1 2 3 3.1 4±2 1.0 9部位-0.1 4 2 0.8 8 7暴露部位 4 9 2 1 6.9 5±2 5.3 6非暴露部位 1 5 2 1 8.0 1±2 4.7 2 T N M分期 5.1 2 7 0.0 0 0 0 期/Ⅰ期 1 3 2 0 7.2 4±2 3.2 8Ⅱ/Ⅲ 期 3 5 2 3 1.1 3±2 6.6 7Ⅳ期 1 6 2 4 9.5 3±2 5.7 6組織學分級 5.8 5 6 0.0 0 0原位鱗癌 9 2 0 1.1 3±1 9.2 5高分化鱗癌 2 7 2 1 0.2 8±2 6.6 4中分化鱗癌 1 7 2 2 0.1 9±2 4.3 8低分化鱗癌 1 1 2 4 3.2 5±2 3.5 7淋巴結或遠處轉移 6.1 0 8 0.0 0 0有2 0 2 4 6.7 4±2 6.3 1無4 4 2 0 4.2 2±2 5.5 9

2.4 CSCC患者血清IL-33表達水平的影響因素分析 Logistic回歸分析結果顯示，淋巴結或遠處轉移（OR=4.369）、組織學分級（OR=3.449）及 TNM 分期（OR=10.444）均是CSCC患者血清IL-33表達水平升高的危險因素。見表2。

表2 CSCC患者血清IL-33表達水平的多因素分析

2.5 ROC曲線評估血清IL-33水平對CSCC患者淋巴結或遠處轉移的診斷價值 將所有CSCC患者血清IL-33表達水平作為檢驗變量，將存在淋巴結或遠處轉移的SCC患者血清IL-33表達水平作為狀態變量，繪制ROC曲線圖發現，血清IL-33表達水平在診斷CSCC患者存在淋巴結或遠處轉移的曲線下面積（AUC）為 0.834（95%CI：0.743～0.924，P＜0.05），當截斷值為 237.25 ng/mL，此時敏感度和特異度分別為92.14%和86.39%。見圖2。

圖2 血清IL-33評估CSCC患者是否存在淋巴結或遠處轉移的ROC曲線

3 討論

CSCC是皮膚科較為常見的腫瘤性疾病，大量研究認為慢性炎性反應與CSCC發生發展密切相關[2-3]，CSCC常常繼發于皮膚慢性潰瘍、日光性角化、瘢痕、盤狀紅斑狼瘡等原有皮疹上也進一步證實炎性反應在其發病機制中的作用[10]。IL-33是IL-1家族中的一種炎性因子，主要由上皮細胞及內皮細胞等表達，當機體細胞或組織損傷或壞死時釋放入血，故而IL-33也有“警報素”之稱[11]。IL-33已被證實參與了如胃癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤性疾病的發病機制中[12]，但IL-33是否參與皮膚腫瘤的發病機制中尚不得知?？紤]到上皮細胞和內皮細胞分泌IL-33，而CSCC則屬于覆蓋有鱗狀上皮的皮膚惡性腫瘤，故而筆者猜測IL-33可能在CSCC的發病機制中扮演了重要作用。檢索文獻發現，國內外關于IL-33與CSCC的相關研究報道較少，Chen等[8]對40例頭頸部CSCC患者的調查研究結果證實，癌組織中IL-33 mRNA、IL-33蛋白及血清中IL-33水平均顯著升高，且血清IL-33表達水平相對較高的患者預后往往較差，在機制上證實IL-33促進腫瘤的局部侵襲與轉移主要通過誘導細胞上皮間質轉化（Epithelialto-Mesenchymal Transdifferentiation，EMT）這一重要途徑；Wen等[13]發現IL-33也可通過促進癌組織中Foxp3+Tregs細胞的過度增殖而參與頭頸部CSCC的發病機制，多項研究證實Foxp3+Tregs細胞與惡性腫瘤的發病機制有關[14-15]；Ishikawa等[16]通過免疫組化證實舌鱗癌組織中IL-33及其受體ST2表達水平顯著升高，且較高水平的IL-33和ST2水平均與發生淋巴結轉移風險呈顯著正相關；但國內林瀚青等[17]對20例（15例喉癌和5例下咽癌）頭頸部CSCC組織中IL-33 mRNA檢測后發現，IL-33 mRNA表達水平顯著降低，且IL-33mRNA高表達水平的患者預后相對較差，這與其他研究結論截然相反的主要原因尚不明確。目前國內對CSCC和IL-33的相關性研究報道較少，筆者研究發現CSCC患者血清中IL-33和癌組織中IL-33蛋白相對表達水平均顯著升高。這一結果提示IL-33可能參與了CSCC的發病機制。

多因素分析結果顯示，組織學分級越低、發生淋巴結或遠處轉移、TNM分期越高，均是CSCC患者血清IL-33表達水平上調的主要危險因素。2013年，布列根和婦女醫院（Brigham and Women’s Hospital，BWH）提出4項CSCC的預后不良因素，其中癌組織“組織學低分化”是其主要的預后不良的因素[18]，研究證明，SCC的組織學分級越低，癌細胞更易發生淋巴結和遠處轉移，預后相對較差[19]；另一方面，本研究采用的TNM分期是參考美國癌癥協會關于非黑素瘤皮膚腫瘤TNM分期系統，該TNM分期系統綜合考慮腫瘤直徑、組織學分化程度及淋巴結和遠處轉移等多項因素，TNM分期系統對評估CSCC的臨床分期有重要意義，TNM分期越高，CSCC患者預后往往較差。研究結果顯示，TNM分期越高，CSCC患者血清IL-33表達水平越高，且TNM分期是CSCC患者血清IL-33表達水平升高的最為重要的危險因素，這也從側面證實血清IL-33水平較高患者易發生淋巴結或遠處轉移這一結論。

早期對CSCC是否發生淋巴結或遠處轉移的評估至關重要，直接決定臨床治療方式及患者的預后。目前臨床上主要通過計算機斷層掃描（CT）、核磁共振成像（MRI）或體格檢查中出現淋巴結腫大繼而進行活檢等確診，在時間及經濟成本均較高。因此，在臨床上亟需尋找一種反應CSCC患者發生淋巴結或遠處轉移，且有較高敏感度和特異度的血清學標志物尤為重要。本研究通過ROC曲線探討血清IL-33在診斷CSCC患者發生淋巴結或遠處轉移的臨床效能，研究結果發現，血清IL-33診斷效能的ROC 曲線下面積達到 0.834（95%CI：0.743～0.924，P＜0.05），敏感度和特異度分別為92.14%和86.39%，因此，血清IL-33有可能作為CSCC患者發生淋巴結或遠處轉移的一項血清學標志物。

綜上，本研究結果發現，IL-33高表達可能參與了CSCC的發病機制，首次采用ROC曲線證實IL-33在診斷CSCC患者發生淋巴結或遠處轉移的臨床效能較好，這為CSCC患者進行臨床分期評估提供理論依據。同時，本研究的不足之處在于樣本量較少，且本研究為一橫斷面研究，日后仍需要較大樣本量的結果來驗證筆者的結論，進一步開展大型隊列研究探討IL-33高表達與CSCC預后的關系。