硫化氫通過抑制氧化應激減輕糖尿病心肌病病變

矯立杰，魏亞新，李鴻珠

(哈爾濱醫科大學 基礎醫學院 病理生理學教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)具有多種特征，包括高血糖、胰島素抵抗、活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加、線粒體功能障礙和內皮功能異常。DCM的發展不同于動脈粥樣硬化、瓣膜病、高血壓和其他常見的心血管疾病致病因素，它本身是一種可能發生心力衰竭的獨立機制。對于其他氣體信號分子，如一氧化氮已經很好地發揮了治療作用，但對硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)的生理作用知之甚少。它也有可能作為一種治療性氣體分子發揮作用。研究表明H2S的供體硫氫化鈉可以增加心肌細胞的存活率、減少ROS的生成[1]。同時給予外源性H2S治療可以改善DCM病變，推測提高H2S的生理水平可能是治療DCM的一種潛在的新的治療選擇。

鑒于H2S具有減輕DCM的作用，并且外源性提供的H2S具有十分不穩定性，增加內源性H2S的產生以發揮抑制DCM的作用尤為重要。本課題組主要研究調控內源性H2S產生的方法及H2S抑制DCM的機制。其中，H2S 通過抑制氧化應激減輕DCM的發生是研究的重點。本文根據查閱文獻并結合本研究論述了DCM與氧化應激的關系及H2S通過抑制氧化應激減輕DCM的機制。

1 DCM與氧化應激作用

慢性高血糖是DCM發生的主要原因，高血糖環境可以誘導細胞產生過量ROS，導致氧化應激，影響線粒體的新陳代謝。適量的ROS可以促進細胞和組織的再生，但是過量的ROS對心血管系統有極大害處，會導致細胞的氧化損傷。ROS引起的氧化應激是導致DCM病變的重要危險因素[4]。在DCM、阿霉素誘導的心肌病的患者和動物模型中觀察到ROS產生增加和抗氧化能力降低[2,3]。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質過氧化的副產物，是氧化應激損傷的重要檢測指標之一[4]。另外，糖尿病心臟模型相對于正常心臟模型可以表達更多的MDA。并且，糖尿病心肌細胞MDA的表達水平和ROS含量均顯著高于正常心肌細胞[5]。同時，糖尿病小鼠心臟組織中Ras蛋白特異性鳥嘌呤核苷酸釋放因子1(Ras protein-specific guanine nucleotide-releasing factor 1，RasGRF1)表達相對于正常小鼠是上調的。RasGRF1可以介導氧化應激作用進一步加重DCM病變程度[6]。當減少RasGRF1時可以減弱氧化應激作用并改善糖尿病小鼠的心臟功能，同時改善心臟結構重構[6]。并且慢性糖尿病發生時可以使心臟組織中的氧化應激相關蛋白p67phox和NOX4水平明顯升高。另外抑制氧化應激相關標志物NOX1、NOX4和線粒體動力相關蛋白的表達均可改善DCM心肌細胞的損傷。這些結果都表明了氧化應激作用與DCM的發生發展有著密切的聯系。尋找通過抑制氧化應激減輕DCM發生的藥物尤為重要。據報道，H2S 可通過下調氧化應激減輕DCM的發生。

2 H2S的產生及代謝

H2S主要是由哺乳動物組織中依賴于磷酸吡哆醛的酶內源性產生的，血漿和組織中H2S的正常水平為50～160 μmol/L。產生H2S的酶主要是胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate thiotrans-ferase，3-MST)以及半胱氨酸氨基轉移酶(cysteine aminotransferase，CAT)[7]。在大多數細胞和組織中，CBS和CSE是合成H2S的主要內源酶。 CBS分布在全身，是肝、腎和腦等組織中內源性H2S產生的關鍵酶。CSE主要存在于心血管系統。與CBS和CSE不同的是，3-MST主要存在于腎、肝和心肌細胞的線粒體中。在非酶作用下，H2S也可以通過某種方式從一部分細胞內的硫磺中釋放出來。例如，在紅細胞和某些組織中已發現在生理條件下含硫氨基酸和維生素B6可以產生H2S。然而，這種方式生產的H2S的確切生物學作用尚未確定。

在生理條件下，H2S主要有以下幾種代謝途徑。在大多數情況下，H2S形成的硫氫根(HS)在線粒體中快速氧化形成硫代硫酸鹽，然后進一步轉化為亞硫酸鹽，最后轉化為硫酸鹽隨尿液排出[7]。H2S也可以通過硫醇-S-甲基轉移酶甲基化形成二甲基硫醚和甲硫醇[8]。此外，與其他兩個氣體信號分子(一氧化碳和一氧化氮)相似，H2S與血紅蛋白具有高親和力，與血紅蛋白相互作用是H2S的分解代謝途徑之一。H2S具有多種生理功能，例如，舒張血管、降低血壓、抗凋亡、抗炎性反應和抗氧化應激。在這些功能中，H2S在抗氧化應激中的作用已成為多年來研究的主要焦點。

3 H2S抑制氧化應激減輕DCM的可能機制

3.1 H2S通過抗氧化應激蛋白酶途徑發揮作用

H2S可以增強抗氧化應激蛋白酶如GPX(glutathione peroxidase)、SOD(superoxide dismutase)和CAT(catalase)的活性發揮抗氧化應激功能并可作為ROS的直接清除劑。在糖尿病心臟病模型中，H2S可以提高GSH/GSSG(glutathione)比值，增強SOD1、SOD2、CAT和GPX的活性及蛋白質表達水平而發揮抗氧化作用[9]。GPX是H2S介導的抗氧化劑衍生物中最常見的，它通過氧化還原反應起作用。人體攝入硒代蛋氨酸后，90%的硒在人體中通過硒的轉硫途徑轉化為硒化物，然后可用于硒蛋白的合成[8]。而GPX中的GPX1至GPX4和GPX6可以與H2O2自由基反應從而中和H2O2[10]。SOD的催化活性包括酶活性中心Cu和Mn的還原氧化，具有非常重要的抗氧化作用。SOD首先將過氧化物修飾成H2O2，隨后CAT或GPX將H2O2轉化為水，最終使ROS的毒性完全消失。并且SOD1和SOD2都能降低H2O2誘導的氧化損傷的發生。在SOD1突變小鼠中，caspase-1和caspase-3的凋亡信號依次被激活：caspase-1在細胞死亡的早期階段激活，caspase-3在細胞死亡的最后階段激活[11]。CAT可以與SOD相互合作催化過氧化物生成水和氧氣，使得過氧化物不會與ROS在鐵螯合物作用下反應生成非常有害物質。在CAT抑制劑疊氮化鈉存在的情況下，過氧化物的含量顯著上升[12]。另外，H2S可以提高SOD的含量來清除H2O2和超氧化物來減輕異丙腎上腺素誘導的心肌缺血損傷后心臟的脂質過氧化[13]。

3.2 H2S 通過非酶抗氧化應激物質途徑發揮作用

H2S還可以通過非酶抗氧化應激物質如GSH等發揮其相關功能。GSH作為一種抗氧化劑，在細胞抵御氧化應激中發揮著重要作用[10]。H2S可通過增加細胞內GSH的含量來保護神經元免受氧化應激，并提高細胞的活力。在缺血/再灌注引起的氧化應激時，GSH水平降低，而H2S可以恢復缺血/再灌注所降低的GSH水平從而減輕氧化應激作用對心肌細胞的損傷。在DCM中H2S也可以發揮相似的作用以減輕DCM病變程度。

3.3 H2S 還可以通過調控某些信號通路發揮抑制氧化應激的作用

核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)是核堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子(nuclear factor erythroid 2，NF-E2)家族的成員之一[14]，對包括ROS和活性氮在內的過氧化物高度敏感。在細胞質內,Nrf2可以與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(kelehSample related protein-1，Keap1)半胱氨酸殘基偶聯，當氧化應激出現之后Keap1可以與Nrf2解偶聯同時釋放出Nrf2，隨之Nrf2移位到細胞核中，而H2S可以促進這一過程[15]。進入到細胞核中的Nrf2可以進一步激活下游靶蛋白的表達，調控抗氧化蛋白酶/非酶的活性，從而發揮抗氧化應激作用[16]。并且，H2S處理30 min后，Nrf2在心肌組織的細胞核中聚集，并保持在一個增加的水平至少2 h。此外，H2S處理24 h 后可升高Nrf2下游的HO-1和Trx1蛋白質的表達[17]。而HO-1可以通過抑制游離血紅素發揮重要的抗氧化作用。并且Nrf2可以介導SOD和GPX蛋白質的表達發揮其抗氧化應激作用。γ-GCS作為GSH合成的一種限速酶，當激活Nrf2信號通路時γ-GCS的含量明顯增加，進一步導致GSH的含量明顯增加[18]。這說明Nrf2信號通路發揮作用主要通過調控HO-1、SOD、GPX和GSH等物質的表達。由此可見，H2S可通過調控Nrf2-Keap1通路發揮抗氧化應激作用。

沉默信息調節因子2相關酶類3(silent mating type information regulation 2 homolog-3, SIRT3)，是一種依賴NAD的脫乙酰酶，主要存在于線粒體中，調節線粒體能量代謝和新陳代謝及防止氧化應激的蛋白質表達[19]。H2S可以降低NAD/NADH(nicotinamide adenine denucleotide)的比值，并且可以增加SIRT3的S-硫酸化和P62上的轉錄活性，并誘導了其靶蛋白OPA1、ATP合成酶β和SOD2的脫乙?；?，導致線粒體活性氧的生成減少，減輕氧化應激對于心肌細胞的損傷[20]。H2S對Sirt3敲除小鼠細胞無保護作用。除此之外，當SIRT3上的Cys256、Cys259、Cys280和Cys283殘基突變時，H2S誘導SIRT3的S-硫酸化作用也會隨之失效。這表明H2S 通過調控SIRT3發揮抗氧化作用減輕DCM的發生(圖1)。

圖1 H2S 通過抑制氧化應激減輕糖尿病心肌病的機制Fig 1 Mechanism of H2S alleviating diabetic cardiomyo-pathy by inhibiting oxidative stress

NOX(nitrogen oxidase)1-5、雙氧化酶1、雙氧化酶2合稱為NOX蛋白家族，這一蛋白家族在全身各個細胞和組織中幾乎都有表達。NOX在機體中發揮著重要的作用，當它接受細胞信號刺激之后會迅速激活產生超氧陰離子，隨后進一步生成ROS等。當抑制NOX通路以后，p67phox、p22phox和NOX4的水平明顯降低，ROS生成減少，細胞抗氧化能力明顯增加[21]。H2S可以抑制這一蛋白家族的活性，進而減少ROS的生成，減輕氧化應激作用對細胞的損傷。然而對于H2S是否可以通過這一途徑減輕DCM發生時的氧化應激作用尚不清楚，希望后續試驗可以加以驗證。

4 問題與展望

目前治療DCM的策略包括運用胰島素及胰島素分泌藥物、口服降血糖藥物、β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和鈣離子通道拮抗劑等。然而，上述合成藥物有許多副作用，包括胃腸紊亂、肝毒性、腹痛和泌尿生殖道感染等[22]。補充H2S可減輕高血糖引起的氧化應激對心肌細胞的損傷[23]，并副作用較小。這提示，H2S可能成為治療DCM的一種新的治療手段。但是對于心血管系統如何穩定的提供H2S以發揮其治療作用的報道卻少之又少。同時，H2S治療DCM的分子機制仍不十分清楚。因此未來還需進一步探究H2S作用于DCM的分子機制及如何穩定提供H2S已達到治療DCM的目的。