大竹蟶Solen grandis 耗氧率及排氨率響應面法分析

張雨，陳愛華，吳楊平，曹奕，陳素華，張志東,2，田鎮,2，李秋潔,2

（1.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

大竹蟶Solen grandis 俗稱蟶子王，是廣泛分布我國沿海的經濟貝類之一，在江蘇呂四漁場內如東、啟東一線歷來具有相當的資源量。但近年來圍填海和港口建設等因素不同程度影響了海洋生境，大竹蟶呼吸代謝狀態受到嚴重挑戰。本課題組嘗試進行大竹蟶池塘養殖。轉向池塘養殖的大竹蟶因養殖地點的不同，海水鹽度、溫度及pH 等也存在顯著差異。研究表明，鹽度影響水生動物鰓纖毛運動和心臟的跳動[1,2]；溫度和pH 變化改變了生物體內各種酶的活力，影響水生動物的呼吸代謝[3,4]。耗氧率和排氨率是反映水生動物呼吸代謝的重要指標，估算貝類養殖容量的重要參數[5]。目前有關魚類[6-8]、甲殼類[9,10]及貝類[11-14]耗氧率和排氨率的研究均有報道。然而目前僅限于單一環境因素的研究，較少考慮環境因素的聯合作用。而研究多種環境聯合條件下大竹蟶的呼吸代謝狀況，對大竹蟶池塘健康養殖具有積極意義。

響應面法是一種解決多變量問題的數學統計分析方法，主要通過提供合理的試驗設計和數據統計分析、評價多種變量之間的交互作用而建立數學模型和三維立體響應曲面圖形，最終得出最優參數組合的多元回歸方程[15-17]。目前響應面法已較多地運用在工藝優化和藥物研發等領域[18]，而在水產動物中的運用研究較少。本研究利用響應面法研究鹽度、溫度和pH 三因素及其聯合效應對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響，利用多元回歸方程模擬出大竹蟶耗氧率及排氨率最高時的養殖條件，以期為大竹蟶養殖條件優化、人工苗種繁育和增殖放流提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大竹蟶平均體質量（5.42±0.23）g，取自江蘇省海洋水產研究所文蛤良種場，選取規格相似，健康無損的個體在聚乙烯水槽中暫養7 d，投喂105ind·mL-1的球等鞭金藻Isochrysis galbana，每日換水一次，實驗開始前停喂1 d。

1.2 單因素實驗

1.2.1 鹽度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

參照朱曉聞[4]等試驗方法，實驗在聚乙烯桶中的恒溫密閉呼吸瓶中進行，每個桶中放3 個大竹蟶，溫度為26℃，pH 為7.82。用沙濾海水、海水晶和淡水將鹽度調節為22、25、28、31 和34，設3 個重復。實驗在白天進行，持續2 h，分別用溶氧儀和氨氮測定儀測定初始和結束時呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮濃度。實驗結束時在精確度0.0001 g 的電子天平上精確稱量大竹蟶總重。

1.2.2 溫度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

設5 個溫度梯度：20℃、23℃、26℃、29℃和32℃，每個溫度設3 個重復，室溫為26℃，采用冰塊或加熱板調節溫度，實驗鹽度為28，pH 為7.82。實驗裝置及方法同1.2.1。

1.2.3 pH 對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

設5 個pH 梯度：7、7.5、8、8.5 和9，每個pH 設3 個重復，室溫為26℃，通過添加NaOH 或HCl 調節至相應pH。實驗鹽度為28，溫度為26℃。實驗裝置及方法同1.2.1。

1.3 多因素實驗

在單因素實驗的基礎上，以大竹蟶耗氧率和排氨率為指標，運用Box-Behnken 模型，選擇三因素三水平的中心組合方案，以鹽度、溫度和pH 為主要考察因素，進行響應面實驗，實驗因素水平編碼見表1，實驗裝置及方法同1.2.1。

表1 因素水平表Tab.1 The design table of factors and levels

1.4 耗氧率及排氨率的測定

分別用YSI 溶氧儀和次溴酸鈉氧化法測定初始和結束時呼吸瓶中海水的溶解氧和氨氮含量。耗氧率OC 及排氨率AE 的計算公式如下：

式中：OC 為單位大竹蟶體質量的耗氧率（mg·g-1·h-1），DO0和DOt分別為實驗開始和結束時水中的溶解氧量（mg·L-1），AE 為單位體質量的排氨率（μg·g-1·h-1），N0和Nt分別為實驗開始和結束時水中NH4+-N 含量（mg·L-1），V 為呼吸瓶體積（L），W 為大竹蟶總重（g），t 為實驗時間（h）。

1.5 數據統計

實驗結果均以平均值±標準差（Mean±SD）表示。單因素實驗數據用Excel2016 進行整理，用SPSS19.0 進行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，最后用Origin8.0 作圖。多因素實驗根據Design-expert 8.0 軟件中BBD 模型設計，用該軟件進行二元二次多項式回歸分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 鹽度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

由圖1 可知，鹽度顯著影響大竹蟶耗氧率與排氨率（P＜0.05），鹽度22～28 時，大竹蟶耗氧率及排氨率均呈上升趨勢，在鹽度為28 時均達到最大值，OC=（0.48±0.10）mg·g-1·h-1，AE=（38.32±5.21）μg·g-1·h-1；鹽度超過28 時，耗氧率及排氨率均呈下降趨勢。單因素方差分析表明，鹽度28 時，顯著高于在鹽度22 與34 時的耗氧率（P＜0.05），與鹽度25和31 時的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；排氨率在鹽度28 時，顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）。

圖1 不同鹽度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.1 Effects of different salinities on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.2 溫度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

不同溫度下，大竹蟶耗氧率及排氨率如圖2 所示：在20～26℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率均隨溫度的升高而增加；在26℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率達峰值，OC=（0.49±0.07）mg·g-1·h-1，AE=（39.13±3.23）μg·g-1·h-1；超過26℃后，大竹蟶耗氧率及排氨率呈下降趨勢。單因素方差分析表明，26℃時顯著高于20℃、29℃及32℃的耗氧率（P＜0.05），與23℃時的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；溫度26℃時，排氨率顯著高于其他溫度組（P＜0.05）。

圖2 不同溫度對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.2 Effects of different temperature on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.1.3 pH 對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響

由圖3 可知：pH 為7.0～8.0 時，大竹蟶耗氧率及排氨率均pH 的升高而升高；在pH 為8.0 時，大竹蟶耗氧率及排氨率均達到峰值，OC=（0.49±0.04）mg·g-1·h-1，AE=（36.25±6.23）μg·g-1·h-1；超過8.0后，大竹蟶的耗氧率及排氨率下降。單因素方差分析表明，pH 為8 時，大竹蟶的耗氧率及排氨率顯著高于pH 為8.5 和9 時（P＜0.05），與pH7 和7.5 時的耗氧率差異不顯著（P＞0.05）；pH 為8 時，顯著高于在pH 為7、7.5 及9 時的排氨率（P＜0.05），與pH8.5時的排氨率差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同pH 對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響Fig.3 Effects of different pH values on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of razor clam Solen grandis

2.2 多因素實驗響應面法分析

按照BBD 設計了17 組多因素實驗，通過RSM建立回歸模型，并對回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗。結果顯示，大竹蟶耗氧率及排氨率回歸模型的F 值分別為149.49 和465.47，P-value 均小于0.0001，表明BBD 優化法可靠，變量對響應值的影響極為顯著，模型具有統計學意義。其次，兩個模型的擬合系數（R2）分別為0.9948 和0.9983，說明模型預測值與實測值擬合度高。校正決定系數（Adj R2）分別為0.9882 和0.9962，均可解釋數據變異性的85%以上。精密度（Adeq Precisior）均大于25%，回歸模型可準確用于結果分析。由表3 可知，溫度一次效應對大竹蟶耗氧率的影響不顯著（P＞0.05）；鹽度和pH 一次效應對大竹蟶耗氧率的影響顯著（P＜0.05）；鹽度、溫度及pH 交互效應對大竹蟶耗氧率影響不顯著（P＞0.05），鹽度、溫度及pH 二次效應對大竹蟶耗氧率的影響顯著（P＜0.05）。因此需要剔除交互作用項，然后對模型重新進行回歸。根據方差分析結果得出大竹蟶耗氧率OC 與鹽度（A）、溫度（B）及pH（C）的二次多項回歸方程。大竹蟶預測值OC 對編碼值自變量A、B 和C 的二次多項回歸方程為：OC=0.48-8.75×10-3A-5×10-3B-0.011C-0.088A2-0.1B2-0.098C2；大竹蟶預測值OC 對實際值自變量A、B 和C 的二次多項回歸方程為：OC=-39.51+0.56A+0.56B+6.27C-9.72×10-3A2-0.01B2-0.39C2。

由表4 可知，鹽度及pH 一次效應對大竹蟶排氨率的影響顯著（P＜0.05），溫度對大竹蟶排氨率的影響不顯著（P＞0.05）；溫度與鹽度、鹽度與pH 交互效應大竹蟶排氨率影響不顯著（P＞0.05），溫度與pH交互效應對大竹蟶排氨率影響顯著（P＞0.05）；鹽度、溫度及pH 二次效應對大竹蟶排氨率影響顯著（P＜0.05）。根據方差分析結果得出大竹蟶排氨率AE與鹽度（A）、溫度（B）及pH（C）的二次多項回歸方程大竹蟶預測值AE 對編碼值自變量A、B和C 的二次多項回歸方程。

表2 實驗設計與結果Tab.2 Box-Behnken design with the observed responses

表4 大竹蟶排氨率回歸模型方差分析Tab.4 ANOVA for the regression model of ammonia excretion rate (AE) in razor clam Solen grandis

大竹蟶預測值AE 對編碼值自變量A、B 和C的二次多項回歸方程為：AE=38.85+1.37A-0.30B+2.91C+0.085AB+0.19AC-0.87BC-6.75A2-7.89B2-11.54C2。

大竹蟶預測值AE 對實際值自變量A、B 和C 的二次多項回歸方程為：AE=-4238.24+41.23A+49.83B+755.92C+9.44×10-3AB+0.13AC-0.58BC-0.75A2-0.88B2-46.16C2。

根據所建立的上述數學模型，得出大竹蟶耗氧率及排氨率的最佳條件為：鹽度28.04，溫度25.93℃，pH8.02，此條件下大竹蟶的耗氧率及排氨率分別為0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。

3 討論

鹽度對貝類呼吸和代謝有重要影響。一般認為，鹽度的改變不僅影響貝類的攝食能力，還影響鰓纖毛運動和心臟的跳動。鹽度過高或過低時，貝類會關閉進出水管，緊閉雙殼，形成組織和外部條件的隔離，呼吸和排泄減慢[1,2]。本研究結果顯示：鹽度的一次效應對大竹蟶耗氧率及排氨率影響顯著（P＜0.05）。在鹽度22～31 范圍內，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規律，鹽度28 時，耗氧率與排氨率最大。這與九孔鮑Haliotis diversicolor supertexta[19]、毛蚶Scapharca subcrenata[20]、褐菖鲉Sebastisucus marmoratus[21]及黃斑籃子魚Siganus oramin[22]等耗氧率及排氨率隨鹽度變化規律一致。

溫度的變化會引起生物體內各種酶活力的變化，影響生物的新陳代謝[3]。本實驗結果表明，溫度20～32℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規律，26℃時，大竹蟶耗氧率及排氨率最大。這與褶紋冠蚌Cristaria plicata、背角無齒蚌Anodonta woodiana、河蜆Corbicula fluminea、銅銹環棱螺Bellamya aeruginosa 等[23]耗氧率及排氨率變化規律相同。水體pH 不僅影響水產動物新陳代謝，還會影響貝類血液的pH 和貝殼的分泌與形成[4]。本試驗結果表明，pH 的一次效應和二次效應對大竹蟶耗氧率和排氨率的影響極顯著（P＜0.01）。在pH 7.0～9.0 范圍內，大竹蟶耗氧率及排氨率呈先增大后減小的變化規律，pH 為8 時，大竹蟶耗氧率與排氨率達到最大。這與縊蟶Sinonovacula constricta[5]、鯔Mugil cephalus[24]及 尖 紫 蛤Soletellina acuta[25]耗 氧率和排氨率變化規律相似。其原因可能是pH 過高或者過低均會損壞貝類鰓纖毛的組織細胞，抑制鰓纖毛的活力，不同程度影響貝類的呼吸與排泄[26]。具體分子機制還需進一步研究。

對貝類耗氧率及排氨率的研究較少考察環境因素的聯合作用及曲面效應。本試驗分析了鹽度、溫度和pH 的交互作用對大竹蟶耗氧率及排氨率的影響，構建的Box-Behnken 模型擬合度很高，說明該模型能很好地解釋大竹蟶耗氧率及排氨率隨環境因素的變化。研究大竹蟶呼吸代謝的最佳條件時，還應進一步考慮放養密度和規格、底質條件、溶氧水平等交互作用對耗氧率及排氨率的影響。利用Design-expert 8.0 統計軟件分析了影響大竹蟶耗氧率及排氨率的3 個因素及其交互作用，得出大竹蟶的最佳呼吸代謝條件為：鹽度28.04，溫度25.93℃，pH8.02，此條件下大竹蟶的耗氧率及排氨率分別為0.48 mg·g-1·h-1和38.97 μg·g-1·h-1。在此環境條件下大竹蟶代謝旺盛，而溫度、鹽度和pH 的聯合效應對于大竹蟶生長和生理的影響還需進一步探討。