交泰丸治療失眠與口瘡的網絡藥理學機制研究

王蔚陸楊若聰賈彩霞龐小涵陳與豐陳愉李思琪趙慧輝

1.北京中醫藥大學中醫學院，北京100029；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京100029

睡眠質量下降常會影響人們的學習與工作，甚至會加重原有病情，繼發其他癥狀。美國一項衛生經濟學研究顯示，失眠患者消耗的醫療資源是非失眠患者的12倍［1］。Johnson以社區人群為研究對象，發現約30%的個體聲稱6～12個月內有失眠經歷［2］。世界衛生組織估計全球有將近7億失眠患者［3］。最新研究發現睡眠與炎癥免疫存在雙向聯系［4］。復發性口腔潰瘍是失眠患者最常出現的癥狀之一［5］，睡眠剝奪會延緩創面的愈合，口瘡引發的疼痛也會影響睡眠［6］。傳統治療基礎上加以適當睡眠調節可促進黏膜修復［7］。睡眠與黏膜損傷關系密切，二者致病機理有待進一步探索。

中醫診療不僅著眼于病的異同，更著眼于機體的差異，辨證可發現心腎不交的不寐與陰虛火旺的口瘡均會出現潮熱盜汗，舌紅少苔，脈象細數等表現［8］，舌為心苗，心主神明，腎生髓，腦為髓海，足少陰經循喉嚨夾舌本，絡氣別入膀胱經，上榮腦髓，虛火內生，上擾清竅是其病機，清心瀉火，引火歸元為其準則。黃連降心火，肉桂鼓腎精，藥簡而力專。交泰丸組方實際源自明代醫易學家韓懋所著的《韓氏醫通·藥性裁成章》，其認為肉桂一錢以應“天一”，黃連六錢以應“地六”，意在天一生水，地六承之。改否卦為泰，故名交泰，書中僅提交泰之名，直至清代王士雄在創作《四科簡效方》錄入安神諸方時，才把方名確定下來，用于治療怔忡不寐。近代醫家不僅用其治療傳統的失眠抑郁［9］，更用其治療糖尿?。?0］、非酒精性脂肪肝［11］、圍絕經期綜合征［12］以及口腔潰瘍［13］等。本文借助近年來逐漸成熟的網絡藥理學異病同治方法［14］探討其有效機制。

1 材料與方法

1.1 交泰丸成分靶點的篩選與獲取通過TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）［15］和SymMap（https：//www.bioinfo.org/symmap.）［16］等數據庫尋找黃連與肉桂的成分，根據口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18兩個參數進行初篩以獲取有效成分及其靶點，并結合文獻報道補充未預測到的信息。按服務器規定生成mol2格式文件，向SwissADME（http：//www。swissadme.ch/index.php）數據庫輸入上述文件計算小分子化合物理化性質，以支持檢索發現。并利用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）規范靶點名稱，最后將中藥靶點取并集，得到交泰丸總的作用靶點。見表1。

1.2失眠和口瘡共有靶點的獲取分別向OMIM（http：//omim.org/，updatein 2018-07-03）、Gencards（http：//www.genecards.org/，version 4.8.0）、Drugbank（https：//www.Drug bank.ca/，version 5.1.1）輸入由Pubmed檢索得來的Mesh術語，獲得口瘡基因靶點與失眠基因靶點。將兩種疾病靶點取交集，就是失眠與口瘡的共有靶點。

1.3 方劑-成分-靶點-疾病網絡的構建把交泰丸總的作用靶點與口瘡與失眠的共有靶點再取交集，就是交泰丸治療口瘡與失眠可以共同起效的位點。將上述方劑、藥物成分、靶點與共有疾病作為節點，利用Cytoscape軟件構建網絡模型。

1.4 共有靶點網絡分析將交泰丸治療上述兩種疾病的作用靶點導入String（https：//string-db.org/，version10.5）數據庫中獲取蛋白相互作用關系，并用Cytoscape軟件繪制PPI網絡。應用MCODE算法進行模塊分析，cytoHubba插件篩選核心靶點，并把核心靶點分別導入DisGeNET（http：//www.disgenet.org，version 5.0）數據庫中挖掘基因蛋白分類信息及其與疾病的聯系。最后使用Metascape（http：//metascape.org/，version 3.0）富集平臺，導入關鍵靶點，設置物種為人，進行GO分析和KEGG通路分析，根據P值大小進行排序，保留排名靠前的結果，借助bioinformatics平臺繪制高級富集分析氣泡圖。

1.5 構建方劑成分-共病靶點-通路網絡圖運用CytoScape繪圖工具構建交泰丸成分-共病靶點-通路網絡圖，分析Metascape富集分析參數，依據P值得到前15個核心通路，與上文遴選得到的活性成分靶點相關聯，最終得到19個有效成分的69個基因靶點并制圖。

2 結果

2.1 交泰丸治療口瘡與失眠共同起效的作用靶點的獲取藥物方面，通過檢索TCMSP、Swisstarget等藥學數據平臺并結合文獻報道補充未預測的化合物靶點，結果顯示交泰丸中黃連有10個有效成分，355個靶點；肉桂有9個有效成分，183個靶點。兩味中藥搜索結果取并集，最終得到19個有效成分，456個靶點，標準化蛋白質靶點信息，校正為官方名稱（official symbol）。

表1 交泰丸篩選得到的候選化合物

疾病方面，通過向OMIM、Gencards、Drugbank數據庫輸入由NCBI檢索得來的醫學專業術語insomnia進行查詢，最終得到2622個失眠靶點。類似地通過向上述數據庫輸入Oral ulcer進行查詢，可以得到4124個口瘡靶點，然后將兩種疾病的靶點取交集共得到813個共有靶點，就是導致兩種疾病發生的共有靶點，同樣，它也是藥物精準治療的位點。

第三步，將方劑總的靶點與疾病共有靶點取交集，就是交泰丸治療以上兩種疾病可能顯效的位點，共有108個，創建思維導圖。見圖1。

圖1 獲取交泰丸“異病同治”關鍵靶點的思維導圖

圖2 交泰丸治療失眠和口瘡方劑-成分-靶點-共有疾病網絡關系圖

2.2 藥物-成分-疾病網絡構建將108個關鍵靶點導入Cytoscape中構建方劑-成分-靶點-共有疾病的系統網絡，合并簡化用于后續分析處理（圖2）。共涉及129個節點，386條邊。節點表示方劑、成分、靶點、共有疾病，邊表示節點彼此的聯系。形狀設置為圓，其中六邊形表示方劑、圓形表示黃連成分（10個）；V字形表示肉桂成分（9個）；菱形表示靶點（108個）；八邊形表示共有疾病。度值越大，節點越大，顏色越深越重要。根據Network Analyzer拓撲運算結果，找出中心度值、親中心度值、等級值均值篩選后交集靶點較高的10個gene symbol（ACHE、BCHE、CHRM1、ADRA2C、PARP1、AR、CYP2D6、F3、ESR1、PTGS1）。

2.3 共有靶點蛋白相互作用網絡構建為進一步了解共有靶點的相互關系。將靶點導入String中獲取PPI網絡，并用Cytoscape繪制模型，節點表示蛋白，邊表示相互作用關系。節點越大，顏色越深，度值越大越重要（圖3）。網絡共涉及107個節點，848條邊，應用MCODE算法識別密集連接組件，Cluster Finding參數設置為Haircut，degree cutoff：2，Node score Cutoff：0.2，K-Core：2，Max.Depth：100，P<0.05表示差異有統計學意義，結果涉及6大模塊（圖4），用字母顯示（K1，K2，K3，K4，K5，K6），最后根據度值用cytoHubba插件遴選出聯系最緊密的10個橫行霸道（AKT1、VEGFA、TLR4、ESR1、MMP9、DRD2、RELA、PIK3R1、MTOR、MAOA）。

圖3 交泰丸治療失眠和口瘡共有靶點蛋白相互作用網絡

2.4 共有靶點GO分析和KEGG通路分析將108個關鍵靶點輸入到Metascape生物注釋富集分析平臺中，設定物種為人，對其進行基因本體分析和通路分析，發現基因靶點主要涉及一些神經內分泌遞質有關的分子功能；作用場所為神經突觸；血液循環、免疫炎癥與體內激素的釋放是其發揮生物學效應的必要環節，通路分析發現cAMP、HIF-1和Ca2+信號，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE通路［17］與疾病的進展聯系緊密。上海寶山［18］的一項口腔黏膜疾?。∣MD）與糖尿病抽樣調查，可以佐證神經內分泌的紊亂是消化道黏膜損傷的獨立危險因素。對P值進行排序，根據Analysis-Report保留數據，借助bioinformatics平臺繪制氣泡圖（圖5）。

圖4 交泰丸治療失眠和口瘡共有靶點蛋白相互作用模塊分析

2.5 交泰丸成分-共病靶點-通路網絡圖的構建運用CytoScape構建交泰丸成分-共病靶點-通路網絡。通過Metascape平臺，參照FINAL_GO文件中的P值，遴選前15個核心通路，然后與方劑有效活性成分靶點相關聯，最終得到103個節點367條邊的網絡，基因節點均設置為圓形，肉桂成分為方形，黃連成分為三角形，通路為V字形；節點大小顏色透明度反映度數，節點越大顏色越深說明越重要。見圖6。

圖5 交泰丸治療失眠和口瘡共有靶點的KEGG通路分析、GO分析（細胞成分、分子功能與生物過程）的高級富集分析氣泡圖

表2 交泰丸治療失眠與口瘡的KEGG富集分析前15位通路

2.6 靶點蛋白歸屬與相關疾病將10個核心靶點導入DisGeNET中，獲取蛋白歸屬信息，結果顯示AKT1、PIK3R1、MTOR屬 激 酶，VEGFA與 信 號 轉 導 有 關，ESR1為核受體，MMP9屬于酶，RELA屬轉錄因子，其余未明。檢索發現基因多與神經、免疫、消化系統與內分泌代謝疾病有關。AKT1與精神行為障礙有關（度值分數0.9），VEGFA與皮膚和結締組織疾病有關（0.6），TLR4與糖尿病神經病和克羅恩病有關（0.51、0.5），ESR1與乳房惡性腫瘤有關（1），MMP9與胃潰瘍有關（0.5），DRD2與情緒障礙精神抑郁有關（0.5），RELA與結腸炎有關（0.55），PIK3R1與胰島素抵抗有關（0.6），MTOR與局灶性Ⅱ型皮質發育不良有關（0.74），MAOA與精神情緒有關（0.91），提示精神情志疾病，炎癥免疫介導的消化道黏膜損傷與以上基因相關。

3 討論

圖6 交泰丸成分-共有疾病靶點-通路網絡關系圖

3.1 化合物與疾病通過檢索化合物來源數據庫檢索交泰丸化合物成分發現，α-松節烯與GABA-苯二氮卓（BZD）受體直接結合，延長GABA能突觸傳遞時程，在不影響非快動眼睡眠（NREMS）質量的情況下增強NREMS的數量，顯示出增強睡眠的特性［19］。1-環己基二乙酸單酰胺為加巴噴丁的中間體，加巴噴丁結構與GABA類似，但不激動受體，對病理興奮灶起到不同程度的抑制作用，快速恢復腦細胞的高級功能，維持神經內環境穩態，改善睡眠。棕櫚油酸可預防SHRSP大鼠因腦血管疾病引起的死亡，在給予1%棕櫚油酸的飲食后可顯著提高其存活率，并且在攝入過量NaCl的情況下，中風發生率也不會升高，顯示出強大的腦血管保護作用［20］。此外，還可調節下丘腦-垂體-腎上腺軸和單胺能通路來延緩動物模型腸易激綜合征樣胃腸功能障礙的發展。通過促進單胺氧化酶的氧化脫氨基，降低額前皮質和杏仁核中的5-羥色胺含量，對自主神經高級中樞和植物神經系統進行調節，減弱應激誘導的去甲腎上腺素的變化，增強大腦區域的防御功能，從而達到改善睡眠、防治神經衰弱的目的［21］。右旋龍腦極低劑量下即可對GABA受體Cl-電導產生高效的正調節作用，用于鎮痛和麻醉［22］。表小檗堿為膽堿酯酶抑制劑，對阿爾茨海默?。ˋD）有潛在治療作用［23］，一項有關睡眠調節與AD發病機制的研究表明，NREMS小幅增加可以改善小鼠模型中Aβ病理沉積從而緩解病情。黃藤素具有很強的吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）抑制活性。體內研究可減少炎細胞浸潤，抑制結腸MPO活性，防治結腸炎小鼠模型腸黏膜損傷，預防腸道菌群失調和調節色氨酸分解代謝［24］。以上化合物可通過改善腦供血，保護腦細胞，抑制神經沖動，降低機體對應激的敏感性，從而改善睡眠，患者只有心情舒暢，神經內分泌與免疫系統才能正常工作，炎癥介質才可清除，黏膜潰瘍才會早日愈合。

3.2 基因與疾病基因既是疾病發生的原因，也是藥物作用的靶點，Hits欄中一些關鍵靶點，探討交泰丸起效的藥理機制。細胞色素P450酶系（CYP2D6）參與氧化多種化合物，如咖啡因的代謝，奧美拉唑硫氧化以及咪達唑侖的羥基化。劉要武等［25］認為黃連瀉心火可能與降低尿兒茶酚胺有關，肉桂溫腎陽可能與提高尿17羥皮質類固醇有關，測定以上指標不僅可以檢測病情，同時也為心火亢盛，腎陽不足癥狀的治療提供了思路。對部分患者應用交泰丸，以上指標均趨于正常，癥狀明顯改善，可見該酶系可能在機體代謝方面發揮了重要作用。內源性大麻素受體介導許多復雜反應，包括飲食、記憶、焦慮、胃腸蠕動、慢性疼痛等，可能與下丘腦線粒體呼吸調節有關。該受體天然合成阿片類成分，包括芬太尼、丁丙諾啡和美沙酮等。激動劑與其結合可緩解焦慮抑郁的情緒，提高痛閾，改善睡眠［26］。AHR能調整生物鐘，恢復人體正常節律，有利于免疫調節與損傷修復［27］。RAB7B負調控巨噬細胞中的TLR4信號傳導，與腦功能相關。NO介導冠狀血管中VEGF誘導的血管生成并可以改善腎小球的功能。ICAM蛋白是白細胞黏附蛋白LFA-1的配體，在白細胞跨內皮遷移過程中促進內皮細胞的組裝與炎癥反應的進程，其中IL-26可能在黏膜免疫的局部機制中起作用。PTGS1在胃上皮細胞和牙周疾病中起細胞保護作用［28］。MMP2參與組織修復。MPO通過PMN誘發，生理情況下即可催化次氯酸生成，這些中間體顯著增強其殺菌活性。另有雌孕激素與消化道潰瘍相關性的流行病學報道顯示，女性患失眠與口瘡的概率高于男性［29］。以上靶點的分子機制均提示了交泰丸不僅可以緩解緊張情緒，改善睡眠，同時還可以通過調節體內激素釋放，從而介導免疫炎癥促進黏膜損傷修復。

3.3 AGE-RAGE信號通路與疾病糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路可激活多個細胞內信號途徑，可增強NF-κB活性，介導炎癥因子IL-6及其受體亞基參與免疫調節和止痛信號的傳導［30］。在糖尿病神經癥狀中，該通路加重了神經系統功能的紊亂和對疼痛的敏感性。而與失眠、口瘡相關的多數靶點都有cAMP和Ca2+的參與，中醫主張辨證論治與治病求本，交泰丸有利于改善諸如cAMP參與調節的許多生物進程，包括代謝、分泌、鈣穩態等，最后是HIF-1信號通路與皮膚黏膜損傷有關，中藥成分針對以上風險起效，比如消腫止痛，調節免疫，修復傷口，從而促進黏膜潰瘍愈合，改善睡眠質量。

綜上所述，古人用交泰丸治療心腎不交的怔忡失眠，奉為圭臬，現將其應用到消化道黏膜損傷的治療，收到良好的效果，這為方劑再開發提供了循證依據。網絡藥理學研究發現，交泰丸治療失眠和口瘡主要是通過改善中樞神經系統的血供，保護腦組織，調控突觸遞質的釋放，從而減少不良刺激對機體的影響，使患者克服消極情緒，恢復神經內分泌的穩態，調節免疫，清除炎性介質，加速潰瘍愈合，方劑配伍不僅協同增效，而且能夠在抑制促炎細胞因子產生的情況下，保留其抗炎活性，在達到治療疾病的同時，減少對機體的損傷。最后是通路基因靶點的高度擬合，提示其可能通過以上相似機制而顯效。由此可見，交泰丸通過多成分、多靶點、多通路起到了異病同治的治療效果。