基于手性固定相的超高效液相色譜-串聯質譜法檢測小麥及其加工制品中的腈菌唑對映體

齊艷麗, 高 婧, 王偉榮, 金 靜, 呂 瑩, 秦 曙

(山西功能農產品檢驗檢測中心, 山西農業大學, 山西 太原 030031)

手性是指實物與鏡像對稱卻不能重疊的性質,手性分子存在一對基團組成相同但空間結構互為鏡像關系的對映異構體,簡稱對映體[1]。具有這種性質的農藥稱為手性農藥。手性農藥在農藥市場中占據重要地位,目前使用的農藥中≥30%為手性農藥[2]。手性農藥對映體在非手性環境下的理化性質沒有明顯差異,但在手性條件下,尤其是生物體內酶、激素等手性環境中,其代謝降解、生物活性及毒性毒理等方面存在顯著差別[3]。近年來,隨著人們對手性化合物的深入了解,建立快速簡單的手性農藥對映體分離及殘留分析方法越來越受到重視。常見的手性化合物拆分方法以色譜拆分法為主。色譜拆分法包括氣相色譜法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法、毛細管電泳法等,其中高效液相色譜法是應用最廣泛的方法。目前高效液相色譜手性拆分方法中,手性固定相法由于具有簡單、快速等優點被廣泛使用[4,5]。

腈菌唑(myclobutanil)屬于三唑類手性殺菌劑,分子中有1個手性中心,存在2個對映異構體S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑[6],其結構式見圖1。腈菌唑目前主要以外消旋體形式銷售并使用,其登記作物主要有黃瓜、香蕉、小麥、梨等[7]。由于用量較小、藥效較高、低毒、對小麥白粉病有較好的防治效果等優點,腈菌唑在小麥上應用廣泛。研究表明,腈菌唑對映體在生物活性、毒性、降解等方面具有選擇性:S-(+)-腈菌唑的殺菌活性明顯優于R-(-)-腈菌唑[8];S-(+)-腈菌唑對柵藻的毒性比R-(-)-腈菌唑高[9];S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在人肝微粒體中代謝具有對映選擇性的差異,人類CYP450酶不代謝R-(-)-腈菌唑[10];R-(-)-腈菌唑在蜥蜴中的富集高于其異構體[11];在葡萄、大鼠肝細胞及肝微粒體中S-(+)-腈菌唑優先降解,R-(-)-腈菌唑相對富集[6,12]。為進一步深入研究手性農藥腈菌唑對映體在殘留降解、環境行為等方面的差異,建立其在不同基質中的分離及殘留分析方法尤為重要。

圖 1 腈菌唑對映體的結構式Fig. 1 Structural formulas of myclobutanil enantiomers

目前,手性農藥腈菌唑對映體在不同基質中的手性殘留分析已有報道。張文華等[13]利用超高效合相色譜(ACQUITYUPC2Trefoil AMY1色譜柱)建立了腈菌唑對映體在黃瓜中的殘留分析方法。張新忠等[14]采用超高效合相色譜(ChromegaChrial CCA色譜柱)-四極桿飛行時間質譜,建立了腈菌唑對映體在蘋果、葡萄和茶葉中的分離及殘留分析方法。Yang等[15]利用超高效合相色譜(ACQUITYUPC2Trefoil AMY1色譜柱)-串聯質譜建立了腈菌唑對映體在煙草中的檢測方法。孫彥等[16]利用超高效液相色譜(Lux Cellulose-4手性色譜柱)-串聯質譜建立了番茄、苦瓜、黃瓜和胡蘿卜中腈菌唑對映體的分離方法。Li等[17]利用一種新型手性固定相(3,5-二氯苯氨基化纖維素鍵合硅膠固定相),用超高效液相色譜-串聯質譜建立了腈菌唑對映體在10種蔬菜及水果中的手性分析方法。

本研究以小麥及其加工制品為研究對象,基于手性固定相,利用的UPLC-MS/MS建立了腈菌唑對映體的分離及殘留分析方法,可用于不同初級農產品及加工食品中的手性農藥對映體的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

腈菌唑標準品(99.9%,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH);乙腈(HPLC級,美國Tedia公司);甲醇(HPLC級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司)、甲酸(HPLC級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司);乙酸銨(HPLC級,天津市光復精細化工研究所);氯化鈉(分析純,北京化工廠);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18(分析純,島津技邇(上海)商貿有限公司)吸附劑;純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

供試小麥樣品來自山西省農業科學院東陽試驗基地,樣品經脫粒后冷凍保存。

1.2 樣品的制備

小麥籽粒樣品:取部分小麥籽粒樣品用粉碎機打碎,得到均質的小麥籽粒樣品。

麩皮和面粉樣品:部分小麥籽粒樣品用磨粉機磨粉、過篩,得到麩皮和面粉樣品。

饅頭樣品:稱取100 g面粉,加入含有1 g干酵母的溫水(約38 ℃)約48 mL,用筷子混合成面團后,手工揉3 min,于38 ℃恒溫箱中醒發1 h,取出再揉3 min成型,在室溫放置15 min,放入已煮沸并墊有紗布的蒸鍋屜上蒸20 min (冒氣時開始計時),取出并蓋上干紗布冷卻40～60 min。將饅頭樣品切成小碎塊,備用。

面團樣品:取300 g面粉,加入溫水(約30 ℃),用筷子混合成面團后,手工揉10 min,在室溫下靜置20 min。將面團樣品切成小碎塊,備用。

煮面水及面條樣品:取部分上述面團樣品用小型面條機壓片,將面片逐漸壓薄至1.0 mm,在將面片壓成2.0 mm寬的細長面條束。量取500 mL自來水于鍋中,在電磁爐上煮沸,稱取50 g面條樣品,放入鍋內,煮至面條芯的白色生粉剛剛消失,立即將面條撈出,以流動的自來水沖淋約10 s。得到煮面水及面條樣品。再將面條樣品切成小碎塊,備用。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取

柔性直流輸電系統孤島運行方式下的故障電流抑制方法//王慶,盧宇,胡兆慶,王柯,李海英,劉海彬//(7):56

小麥及其加工制品中腈菌唑對映體的提取方法采取改進的QuEChERS方法進行。

稱取5 g樣品(小麥籽粒、麩皮、面粉、饅頭及煮面水),加入5 mL水(煮面水樣品不加),加入10 mL乙腈,2 500 r/min下渦旋5 min, 8 000 r/min下離心5 min。

稱取5 g樣品(面團及面條),加入5 mL水,加入10 mL乙腈,12 000 r/min下均質提取1 min,加入5 g氯化鈉,2 500 r/min下渦旋2 min, 8 000 r/min下離心5 min。

1.3.2樣品凈化

吸取上述提取液1 mL于盛有25 mg C18及25 mg PSA吸附劑的小離心管中,2 500 r/min下渦旋2 min, 2 500 r/min下離心2 min。吸取0.5 mL上清液,加入0.5 mL純凈水,混勻,過有機微孔濾膜(0.22 μm),待進UPLC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

色譜條件:Lux Cellulose-1手性色譜柱(150 mm×2.0 mm, 3 μm);流速為0.25 mL/min;進樣量為5 μL;柱溫30 ℃;流動相A為4 mmol/L的乙酸銨水溶液,B為4 mmol/L的乙酸銨甲醇溶液,均含體積分數為0.1%的甲酸;其比例為A: 25%, B: 75%。

質譜條件:電噴霧正離子掃描(ESI+);多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度400 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h;碰撞氣為氬氣,純度>99.999%。腈菌唑定性離子對為m/z288.9/124.9和m/z288.9/69.6;錐孔電壓均為36 V;碰撞能量分別為24 eV和38 eV;其中m/z288.9/69.6為定量離子對。

1.5 標準溶液的配制

準確稱取10 mg(精確到0.1 mg)腈菌唑標準品,用乙腈溶解并定容于10 mL容量瓶中,配成1 g/L的標準儲備溶液,于≤-18 ℃條件下避光保存,備用。

2 結果與討論

2.1 手性固定相的選擇

利用色譜法可以有效地實現手性農藥的分離與檢測,而手性固定相是手性色譜分離的關鍵所在[18]。多糖類物質是液相色譜法中最常用的一類手性選擇劑。Lux Cellulose-1色譜柱以手性選擇劑纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)修飾的硅膠為填料,是改良的多糖型手性固定相,在手性農藥對映體的分離分析中具有較好的拆分效果[19-22]。故本研究選擇Lux Cellulose-1作為手性分離色譜柱。

2.2 腈菌唑對映體的拆分

本研究利用手性色譜柱Lux Cellulose-1在甲醇/水體系下對腈菌唑對映體進行了拆分。已有文獻[20]表明腈菌唑對映體在Lux Cellulose-1手性色譜柱上的出峰順序不隨流動相及柱溫的改變而改變。由此可知,在本實驗儀器條件下,S-(+)-腈菌唑對映體先出峰,R-(-)-腈菌唑對映體后出峰,保留時間分別為4.34 min和5.13 min。如圖2所示,腈菌唑的兩個對映體得到良好的拆分。

圖 2 腈菌唑對映體的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram of myclobutanil enantiomers

2.3 基質效應

在UPLC-MS/MS分析中,尤其是使用ESI源時,由于共流出化合物在色譜系統中的離子競爭,基質效應(離子抑制或離子增強)普遍存在[23]。一般通過比較待測物在樣品及純溶劑中的響應值來確定基質效應的存在[24]?；|效應由Matuszewki等[25]修正的公式來計算:基質效應=(R樣品/R溶劑-1)×100%,其中R樣品為樣品空白基質提取液中腈菌唑對映體的峰響應,R溶劑為乙腈溶液中腈菌唑對映體的峰響應?；|效應為負值時,產生離子抑制效應;基質效應為正值時,產生離子增強效應?；|效應在-20%～0或0～20%時為弱基質效應,在-50%～-20%或20%～50%時為中等基質效應,小于-50%或大于50%時為強基質效應[26]。

腈菌唑對映體在小麥籽粒及其相關加工制品中的基質效應見表1。腈菌唑對映體在小麥及其加工制品中的基質效應均在-20%～0或0～20%之間,表明存在弱基質效應。其中,S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在小麥籽粒(wheat grain)、麩皮(bran)、面團(pasta)、饅頭(steamed bun)和面條(noodle)中存在弱基質減弱效應,S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在面粉(flour)和煮面水(cooking water)中存在弱基質增強效應。

表 1 腈菌唑對映體的基質效應

基質效應產生的機理尚不明確且影響因素眾多。為提高定量結果的準確度及精密度,在農藥殘留分析中通常采用基質匹配標準溶液校準方法來消除與補償基質效應。因此,本文使用基質匹配標準溶液校準方法來定量分析物。

2.4 方法驗證

分別用小麥籽粒、麩皮、面粉、面團、饅頭、面條、煮面水空白樣品基質提取液配制成腈菌唑對映體質量濃度為0.5、1.25、5、12.5、25 μg/L的標準工作溶液,以進樣質量濃度(μg/L)為橫坐標、化合物峰面積響應值為縱坐標繪制標準曲線。

在0.5～25 μg/L的范圍內,腈菌唑對映體的峰面積與其質量濃度間呈現良好的線性關系,相關系數在0.999 5～1之間(見表2)。

表 2 腈菌唑對映體的線性范圍、回歸方程和相關系數(R2)

以3倍信噪比及10倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。S-(+)-腈菌唑和R-(-)-腈菌唑在小麥及其加工制品樣品中的檢出限均為0.2 μg/kg,定量限均為0.5 μg/kg。

在小麥籽粒、麩皮、面粉、面團、饅頭、面條、煮面水空白樣本中添加腈菌唑標準溶液(添加水平為5、50、100 μg/kg),進行回收率測定,添加回收率結果見表3。S-(+)-腈菌唑在小麥籽粒及其加工制品中平均回收率在82%～110%之間,RSD在0.9%～6.8%之間;R-(-)-腈菌唑在小麥籽粒及其加工制品中平均回收率在80%～109%之間,RSD在0.9%～6.8%之間。結果表明該方法具有較好的準確性及重現性。

表 3 腈菌唑對映體在小麥及其加工制品中的平均添加回收率(n=5)

2.5 實際樣品的檢測

將該方法用于實際樣品的檢測。結果表明,在5份面粉、2份面條及2份饅頭樣品中均未檢出(≤LOD)腈菌唑對映體。

3 結論

本文建立了基于手性固定相的UPLC-MS/MS測定小麥籽粒及其加工制品中腈菌唑對映體的殘留分析方法。該方法高效、簡單,同時具有較高的靈敏度及精密度,為手性農藥腈菌唑對映體在初級農產品及其加工制品中的殘留分析提供了有效的方法。