毛細管電泳法高效篩選8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶的核酸適配體

韓詩邈, 趙麗萍, 楊 歌, 屈 鋒

(北京理工大學生命學院, 北京 100081)

8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)是修復DNA氧化性損傷的關鍵蛋白[1,2],能夠將DNA雙鏈中的氧化損傷產物8-oxoG通過堿基切除修復途徑(base-excision repair, BER)進行特異性識別和切除[3]。OGG1修復功能如果被抑制,將會導致正常細胞的DNA修復能力降低,DNA損傷蓄積,細胞凋亡增加[4,5]。但對于依賴DNA修復功能的癌細胞來說,OGG1蛋白修復功能的抑制則可以作為治療癌癥的新途徑[6]。此外,OGG1也參與氧化應激等引發的炎癥反應,在一些免疫調節疾病[7,8]中,過敏原會導致OGG1功能完好的上皮細胞產生更加嚴重的炎癥反應[9],因此,削弱OGG1的功能也能在一定程度上緩解炎癥反應。

目前的研究工作多集中于小分子對OGG1功能的影響和調控研究,Donley等[10]篩選了數十種藥物以抑制OGG1的修復功能,目前其藥物的效用和特異性仍需驗證;Visnes等[11]發現了一種OGG1的小分子抑制劑TH5487,能夠減弱OGG1引起的炎癥反應。對OGG1修復功能有抑制作用的配體的相關研究具有重要的理論意義和應用價值。核酸適配體是在體外通過指數富集配體進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)得到的與靶標以高親和力和高特異性結合的單鏈DNA(ssDNA)或RNA。篩選OGG1蛋白的核酸適配體,可作為潛在的OGG1功能的調節因子,控制OGG1修復功能。目前,未見有OGG1蛋白的核酸適配體篩選及相關報道。

圖 1 兩種篩選方法原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of two screening methods

基于CE-SELEX篩選核酸適配體有多種方法[12-19]。其中利用毛細管區帶電泳的多輪篩選方法是較為常用的篩選方法,通常需要3～4輪篩選可獲得核酸適配體;本課題組最近發展了一輪同步競爭篩選方法[20],通過在篩選過程中引入競爭靶標,并增加競爭靶標的濃度來增加篩選壓力,同步提高篩選序列的親和力和特異性。本文基于多輪篩選和一輪同步競爭篩選方法,篩選了OGG1的核酸適配體。篩選的示意圖如圖1所示,在競爭篩選中增加競爭靶標單鏈結合蛋白(SSB)的濃度就可以獲得ssDNA與OGG1穩定結合的復合物;多輪篩選需要將ssDNA與OGG1的復合物收集后PCR形成Sub ssDNA以重復多輪篩選過程,收集親和力不再提高的輪次的復合物,并利用高通量測序對兩種復合物在PCR后獲得的ssDNA進行分析。采用分子對接分析預測了核酸適配體Apt 1與OGG1的結合位點,發現該適配體可能與OGG1蛋白的活性口袋區域結合,有望成為該蛋白的調控因子。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀配熒光檢測器(美國Beckman-coulter公司)、S1000TMThermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)、Fresco21低溫離心機(美國ThermoFisher Scientific公司)、PICO21臺式高速離心機(美國ThermoFisher Scientific公司)、300 V/400 mA/75 W Power凝膠電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

熔融石英毛細管:75 μm i.d.×50.2 cm (40 cm有效長度)(河北鑫諾光纖色譜有限公司)。硼酸、硼酸鈉、氫氧化鈉(分析純,北京化工廠)。OGG1重組蛋白(美國ImmunoClone公司); 80 nt熒光素標記(FAM)標記的ssDNA核酸庫:5′-FAM-AG-CAGCACAGAGGTCAGATG-40-CCTATGCGTGCT-ACCGTGAA-3′(兩端為20 nt引物區固定序列,中間為40 nt的隨機序列)。引物P1: 5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′,標記熒光的引物5′-FAM-P1:FAM-5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′),引物P2:5′-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 溶液配制

毛細管電泳分離緩沖溶液:50 mmol/L硼酸-硼砂溶液(pH 7.8)。緩沖液需經0.22 μmol/L濾膜過濾后使用。ssDNA核酸庫固體粉末,使用前需按照說明用超純水溶解,配制母液。配制好的母液于94 ℃變性處理5 min,冷卻至室溫后取出備用。根據實驗需要用孵育緩沖溶液稀釋蛋白質和核酸溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1毛細管電泳條件

電泳運行緩沖液為50 mmol/L pH 7.8硼酸-硼砂緩沖溶液;分離電壓為15 kV;分離溫度為25 ℃。進樣壓力為3.45 kPa,時間5 s。激光誘導熒光檢測器(LIF)檢測激發和發射波長分別為488 nm和520 nm;毛細管在樣品進樣前需依次使用0.1 mol/L NaOH、H2O和電泳緩沖液沖洗3 min。使用新毛細管時按照常規活化方法處理[21]。

1.3.2PCR擴增條件及產物濃縮和純化

詳細步驟參考本課題組已報道的方法[21],具體如下。

PCR擴增:將引物P1、P2、收集模板、2×Taq DNA聚合酶預混液、雙蒸水混合,95 ℃預變性5 min,變性10 s, 59 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s;循環20次后,72 ℃后延伸10 min。

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳:將PCR產物與DNA凝膠加樣緩沖液混勻后依次注入進樣孔中,90 V下電泳40 min,用凝膠成像分析儀拍照記錄。

產物濃縮:PCR產物加入3 mol/L醋酸鈉溶液及-20 ℃預冷的無水乙醇混勻,15 000 r/min離心15 min;加入70%乙醇洗滌沉淀,棄去乙醇,沉淀干燥。

產物純化:切下瓊脂糖凝膠電泳上目標條帶,轉入1.5 mL離心管中,搗碎后加入ddH2O,振蕩;加入Tris飽和純苯酚,振蕩后離心;將上清液移入新離心管,加入氯仿-異戊醇(24∶1, v/v),振蕩后離心;將上清液移入新離心管,加入無水乙醇、3 mol/L醋酸鈉溶液,混勻后離心,棄去上清液,室溫下風干沉淀物。

1.3.3序列分析與親和力表征

核酸序列高通量測序及核酸適配體合成均由生工生物公司完成,使用NUPACK分析序列二級結構。平衡解離常數KD計算參考NECCEEM方法[22],利用公式(1)進行計算。

(1)

其中,P0和DNA0是OGG1和ssDNA的初始濃度,ADNA為游離ssDNA的峰面積,Adiss為解離區峰面積,ADNA·P為OGG1-ssDNA復合物的峰面積。

1.3.4分子對接

在RCSB PDB數據庫中檢索ID為2XHI的結構文件,由UCSF Chimera對其進行可視化并繪制出OGG1的3D結構。適配體的3D結構最初由RNA Composer軟件繪制,再通過模式RNA網絡服務器和MDWeb網絡服務器轉換為DNA 3D坐標?；谖墨I[23]和Uniprot數據庫預測OGG1的結合殘基,利用PatchDock對接程序對OGG1與適配體進行全局剛性對接以預測二者的結合模式。對接和模擬過程都優先選擇默認參數,并通過FireDock方法[24]迅速消除PatchDock對接引入的空間沖突,完成側鏈位置和相對蛋白質方向的細化和優化。消除空間位阻后,使用能量分析功能模塊對對接模型根據界面能量得分進行排序。最終選取的對接模型其界面能量得分是最小化的范德華力、去溶劑化、靜電、氫鍵、二硫鍵、p-堆積、脂類相互作用和旋轉異構體偏好的加權組合。

2 結果與討論

2.1 同步競爭法篩選OGG1核酸適配體

在競爭篩選方法中,競爭蛋白的選擇原則主要有兩個,一是可以選擇不同的與核酸序列具有強結合能力的蛋白作為競爭蛋白以達到競爭篩選、提高篩選效率的目的;二是選擇與靶標蛋白具有明顯不同電泳遷移時間的競爭蛋白,以便于區別各自復合物峰,從而高效收集靶標蛋白與核酸序列的復合物。參考本課題組建立的同步競爭篩選法,并考慮SSB能夠無序列選擇性地與單鏈核酸以納摩爾級別的KD結合[20],且其復合物峰與OGG1復合物峰在電泳圖譜中分離度較好,能夠作為競爭蛋白結合與OGG1結合力弱的序列,因此選擇SSB作為競爭靶標。將OGG1靶標、SSB反篩靶與ssDNA核酸庫共同孵育。收集電泳圖中的OGG1-ssDNA復合物部分,進行PCR擴增、純化及高通量測序。SSB反篩靶的存在降低了靶標的非特異性結合,顯著提高了篩選效率,有助于獲得高親和力、高特異性的適配體。

表 1 4條候選適配體序列及其熱力學參數

從圖2可以看出,0.05 μmol/L的核酸庫峰在6 min出現(見圖2a)。加入1.0 μmol/L的反篩靶SSB后,游離核酸峰降低,同時在3.8 min處出現SSB-ssDNA的復合物峰(見圖2b),由于該分離緩沖溶液條件下,加入的SSB蛋白羧基解離導致帶負電的單鏈核酸本身帶電性發生變化,荷質比變小,游離核酸峰遷移時間變快。加入5.0 μmol/L OGG1后,游離核酸庫峰面積降低,在2.5 min處出現OGG1-ssDNA復合物峰(見圖2c)。將5.0 μmol/L OGG1和1.0 μmol/L SSB及ssDNA庫同時孵育,電泳圖中出現兩種復合物的峰(見圖2d)。因SSB蛋白與ssDNA之間具有強結合作用,增大其濃度可以對OGG1與ssDNA的結合形成競爭,從而增加對OGG1適配體的篩選壓力。在圖2d～e中,SSB的濃度由1.0 μmol/L增加到2.0 μmol/L時,SSB-ssDNA復合物的峰面積增大,OGG1-ssDNA復合物的峰面積略有減小。增加SSB的濃度至4.0 μmol/L和8.0 μmol/L,結合加入不同濃度SSB后對OGG1-ssDNA復合物峰面積的統計(見圖3), OGG1-ssDNA復合物的峰面積與2.0 μmol/L相比沒有明顯變化(見圖2a～f),說明OGG1與ssDNA已形成穩定的復合物。通過在Beckman毛細管電泳儀上設置相應的時間程序,收集2.2～2.8 min區段的OGG1-ssDNA復合物,直接進行PCR擴增和純化后,由生工生物科技有限公司進行高通量測序。

圖 2 OGG1蛋白的競爭篩選Fig. 2 Competitive screening of OGG1 a. ssDNA (0.05 μmol/L); b. ssDNA (0.05 μmol/L)+SSB (1.0 μmol/L); c. ssDNA (0.05 μmol/L)+OGG1 (5.0 μmol/L); d. ssDNA (0.05 μmol/L)+OGG1 (5.0 μmol/L)+SSB (1.0 μmol/L); e. ssDNA (0.05 μmol/L)+OGG1 (5.0 μmol/L)+SSB (2.0 μmol/L); f. ssDNA (0.05 μmol/L)+OGG1 (5.0 μmol/L)+SSB (4.0 μmol/L).

圖 3 OGG1-ssDNA復合物峰面積變化Fig. 3 Peak area change of OGG1-ssDNA complex

2.2 高通量測序及結果分析

剔除測序結果中讀碼區段錯誤及引物多聚體,選擇頻次最高的4條序列OGG1-Apt 1、2、4、6(見表1)。利用NUPACK、M-fold軟件模擬序列二級結構及預測熱力學參數,結果顯示這些序列普遍形成莖環結構(見圖4)。OGG1-Apt 1與OGG1-Apt 2在37 ℃時的ΔG較其他兩條序列更低,說明這兩條序列更易折疊成穩定的二級結構。

圖 4 4條候選序列的二級結構Fig. 4 Secondary structure of four candidate aptamer sequences

2.3 候選適配體的親和力表征

通過CE方法對4條候選序列Apt 1、2、4、6進行親和力表征并計算其KD值。圖5中,0.2 μmol/L的Apt 1、2、4、6的電泳峰均在5.3 min處出現。加入5.0 μmol/L OGG1后,游離序列峰降低,在2.5 min處出現復合物峰(OGG1-Apt 1、2、4、6復合物),以及復合物峰與游離序列峰之間的解離區。通過對復合物峰、解離區、游離核酸峰三者峰面積的處理計算,OGG1-Apt 1、2、4、6的KD值分別為1.7±0.1 μmol/L、2.6±0.2 μmol/L、2.8±0.2 μmol/L、1.8±0.1 μmol/L(見圖5)。

2.4 多輪篩選法篩選OGG1核酸適配體

多輪篩選法是將核酸庫和靶標混合物孵育后進樣,收集核酸-靶標復合物,并進行PCR擴增、核酸純化,得到次級庫(Sub-ssDNA),然后進行下一輪篩選。通常在4輪以內便能得到高親和力的適配體。為了驗證競爭篩選的結果,在相同的篩選條件下又采用多輪篩選法進行了篩選驗證。

在第一輪篩選中,將0.2 μmol/L的ssDNA核酸庫與5.0 μmol/L OGG1混合孵育15 min后,進行CE分析。在圖6-Round 1中,游離核酸峰出現在5.1 min處,加入OGG1后,游離核酸峰面積降低,在2.5 min處出現OGG1-ssDNA復合物峰。設置相應的時間程序,對區間2.0～3.0 min的復合物進行收集,經對稱PCR擴增、不對稱PCR擴增及純化過程,得到第一輪的次級庫(Sub ssDNA1)以用于第二輪篩選。將第一輪得到的次級庫與5.0 μmol/L OGG1混合孵育15 min后,進行CE分析,在圖6-Round 2中,加入OGG1后游離Sub ssDNA1峰面積顯著降低,在2.5 min處出現復合物峰,收集1.8～3.0 min區段復合物。經對稱PCR擴增、不對稱PCR擴增及純化過程,得到第二輪的次級庫(Sub ssDNA2)以用于第三輪篩選。保持篩選條件不變,將Sub ssDNA2與OGG1混合孵育進行第三輪篩選(圖6-Round 3),收集1.9～3.0 min區段內復合物。隨著篩選輪次的不斷增加,與靶標弱結合的核酸序列不斷被去除,使得親和力更高的核酸序列保留下來。經三輪篩選后,分別計算蛋白與核酸初始庫和次級庫間的KD值:第一輪KD值為3.0 μmol/L,第二輪KD值為0.8 μmol/L,第三輪為1.0 μmol/L。實驗結果表明,第二輪獲得的核酸序列的親和力較第一輪有一個數量級的提升,第三輪與第二輪所得核酸序列親和力差別不大,并略弱于第二輪。因此,將第二輪獲得的次級庫經PCR擴增、純化,送至生工生物科技有限公司進行高通量測序。

圖 6 OGG1蛋白適配體3輪篩選的電泳圖Fig. 6 Electrophoretograms of three rounds screening of OGG1 protein′s aptamer

表 2 多輪篩選與競爭篩選序列對比

2.5 高通量測序及結果分析

分析高通量測序結果,去除測序結果中讀碼區段錯誤及引物多聚體,選取其中最高頻次的3條序列。將結果與競爭篩選法得到的序列進行對比(見表2),多輪篩選法篩選出的3條適配體序列與競爭法得到頻次最高的3條適配體的序列相同。在多輪篩選中經過3輪篩選得到的序列頻次最高達到1 521次,而競爭篩選方法得到的適配體頻次則較為均一(100次左右),多輪篩選過程是將可與靶標結合的核酸序列通過逐輪篩選富集,而同步競爭篩選法則是在共同孵育時,為靶標提供了一個強結合的反篩靶,通過競爭結合以更有效地獲得高親和力和高特異性的適配體序列。因此當存在合適的競爭蛋白的情況下,同步競爭篩選法僅通過一輪篩選即可獲得親和力和特異性更好的適配體,且使篩選過程加快,篩選時間和費用成本降低。

2.6 OGG1與Apt 1的分子對接分析

PatchDock是一種高效的基于幾何形狀互補增強的剛性對接方法。在PatchDock中輸入兩個分子的序列,并計算其中一個作為配體的分子相對于另一個作為受體的分子的三維變換。本次分析的兩個分子是其中親和力最高的OGG1-Apt 1及OGG1,根據給定的分子,PatchDock首先根據表面形狀(凹陷,凸起或平整)將其表面分解成幾個模塊。然后,它執行幾何散列算法以匹配具有平整形狀的區塊和具有凸起形狀的模塊,并生成一組有效的變換。將一組評分函數應用于每個候選變換來進行更深入的評估用以估計所獲得的復合物的原子去溶劑化能量和形狀互補性。最后,應用均方根偏差聚類(RMSD)將冗余的解決方案排除。在PatchDock成功對接并由FireDock進行細化后,選擇10個原始的對接結果進行結合分析。

通過使用PyMol[25]進行對接結果分析,并基于全局自由能和結合殘基選擇最優的3個結果。OGG1在245～270位氨基酸殘基處都具有螺旋-發夾-螺旋結構,該處是DNA的結合部位,同樣也是酶的催化活性部位;Arg154和Arg204構成了識別8-oxoG-C堿基對的基礎結構[26]; Asn149能夠利用氫鍵將8-oxoG與OGG1形成的空隙填補;Cys249和Phe319之間會形成OGG1對8-oxoG的識別口袋,當氧化損傷發生產生的8-oxoG被修復時會插入該識別口袋;Gln315也對蛋白對底物的識別有用。分析對接結果顯示從5′～3′端的50～80位的適配體殘基與指定用于DNA和8-氧代鳥嘌呤結合的兩個主要活性位點結合(見圖7)。在OGG1適配體復合物中觀察到不同類型的相互作用,即56個極性接觸、26個范德華相互作用、39個氫鍵、6個疏水相互作用、14個離子相互作用和70個芳族相互作用。分子對接結果表明所篩選的適配體的50、51位胞嘧啶能與Arg154和Arg204形成氫鍵,且能夠結合在OGG1蛋白的識別口袋上。

圖 7 OGG1的活性位點的殘基名稱和標識符Fig. 7 Residue names and identifiers of active sites of OGG1 OGG1-Apt 1 complex showed that the binding of the last 50-80 residues (from 5′ to 3′) was involved in the inhibition of the active site of OGG1.

3 結論

本文建立和比較了兩種OGG1蛋白的核酸適配體篩選方法,即同步競爭篩選法及多輪篩選法。二者篩選到的3條適配體序列相同,同步競爭篩選法效率更高,可通過一輪篩選獲得高親和力、高特異性的適配體。分子對接分析表明,所篩選的Apt 1適配體可能結合于OGG1蛋白的活性口袋中,表明該適配體有望作為OGG1潛在的功能調控因子,抑制其修復作用。適配體對OGG1作用的相關研究正在進一步展開。