衍生化-氣相色譜-三重四極桿質譜法測定潑尼松龍中聯氨

錢 沖, 張 梅,2, 劉珊珊, 勾新磊, 王 尉, 胡光輝,2*

(1. 北京市理化分析測試中心, 有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室北京 100089; 2. 北京市食品安全分析測試工程技術研究中心, 北京 100089)

聯氨(N2H4)是一種無色、油狀、易燃的液體,通常以水合聯氨(N2H4·H2O)的形態存在,是一種重要的化學試劑,被廣泛應用于工業、農業和軍事等領域,在醫藥、農藥、塑料、染料和火箭燃料等行業發揮著重要作用[1]。聯氨具有一種類似氨的刺鼻性氣味,是腐蝕性極強的強堿,對人體危害較大,是一種刺激性強烈的皮膚致敏物,會損害人體的肝臟、肺、腎臟、血液和中樞神經系統,國際化學安全項目及綜合風險信息系統根據該系統的證據特征權重給予聯氨B2的分級(可能的人類致癌物質)[2]。潑尼松龍(prednisolone)化學名稱為11β,17α,21-三羥基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮,是一種廣泛用于臨床治療的腎上腺糖皮質激素藥物,具有免疫抑制、抗炎、抗過敏和抗病毒等功效[3]。鹽酸氨基脲是一種重要的化工中間體,作為醫藥原料可用于制取硝基呋喃類等藥物,是潑尼松龍合成的重要原料,而水合聯氨又是鹽酸氨基脲合成的原料,所以在潑尼松龍的合成過程中,鹽酸氨基脲的使用很有可能會引入聯氨的殘留[4]。根據歐洲藥事管理局和美國食品藥品管理局的法規要求,基因毒性雜質的毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern, TTC)限度為1.5 μg/d,潑尼松龍每天最高服用劑量為250 mg,因此潑尼松龍中聯氨的可接受限度為6 μg/g。一般藥企在生產潑尼松龍時,為了安全起見,當聯氨的殘留量低于可接受限度的10%時,才可以確定潑尼松龍產品是安全的,所以本研究將潑尼松龍中聯氨的限度定為0.6 μg/g。潑尼松龍中聯氨的殘留會直接影響用藥安全,威脅人們的身體健康。目前,國內外還沒有出臺相應的法律法規和標準來管控藥物中聯氨的殘留限值[5]。所以,建立一種簡便快捷、準確可靠、靈敏度高、選擇性好的潑尼松龍中痕量聯氨的測定方法,對保障臨床用藥安全具有重要意義[6]。

聯氨具有強極性和強還原性,其理化性質不穩定,很容易被氧化,在空氣中易吸濕冒煙,又因缺少發色團,相對分子質量太小,檢測起來難度很大。目前聯氨常見的檢測方法有分光光度法[7]、氣相色譜法(gas chromatography, GC)[8,9]、氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[10,11]、液相色譜法(liquid chromatography, LC)[12,13]、液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)[14]、離子色譜法(ion chromatography, IC)[15]、熒光分析法[16]等。上述方法中,分光光度法靈敏度太低,不能滿足低檢出限的要求;GC、LC、IC的基質干擾大,專屬性差,復雜基質樣品中的其他組分易干擾其檢測分析;GC-MS的基質效應較大,重復性不好,累積進樣后檢測結果偏差較大;LC-MS/MS對實驗室條件要求較高,儀器昂貴,檢測成本高,不利于檢測方法的普及;熒光分析法需要構建特定的熒光探針,操作繁瑣。相比較而言,氣相色譜-三重四極桿質譜法(gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, GC-MS/MS)具有檢測成本低、操作簡便、靈敏度高、專屬性好、基質干擾小、基質效應低等優點[17],目前關于藥物中聯氨的GC-MS/MS檢測方法報道較少,缺乏相關研究。周延生等[18]、侯勤勤等[19]采用丙酮溶液(每毫升丙酮中加入1 μL冰乙酸)作為萃取劑和衍生化試劑,分別對藥物和土壤中的聯氨進行衍生和超聲提取,再使用GC氮磷檢測器(nitrogen phosphorus detector, NPD)對聯氨進行測定。該方法需在添加冰乙酸和超聲條件下進行,樣品、試劑用量大,實驗操作和NPD檢測器維護起來繁瑣費時。此外,由于樣品處于未溶解狀態,會存在聯氨提取和衍生不完全的可能。因為潑尼松龍不能溶于丙酮,本研究先采用稀釋溶劑甲醇-二氯甲烷(14∶23, v/v)溶解潑尼松龍,再在丙酮-稀釋溶劑(9∶1, v/v)中進行稀釋、衍生化,聯氨與丙酮的衍生化反應無需在添加冰乙酸和超聲條件下進行,也無需再添加其他試劑進行萃取操作,聯氨與丙酮可瞬間發生衍生化反應,從而直接實現潑尼松龍中聯氨的快速測定。本文建立了衍生化-GC-MS/MS檢測潑尼松龍中聯氨的方法,并進行了相關的方法學驗證,取得了滿意的結果,為潑尼松龍及其他藥物中聯氨的檢測和監控提供了科學依據和技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8040氣相色譜-三重四極桿質譜儀,GCMSsolution 4.30工作站(日本Shimadzu公司); XPE105電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)。

甲醇、二氯甲烷、丙酮(色譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司);冰乙酸(分析純,北京化工廠);聯氨標準溶液(1 000 mg/L,國家有色金屬及電子材料分析測試中心國標(北京)檢驗認證有限公司);潑尼松龍標準品(純度為99.74%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);潑尼松龍樣品(某制藥公司提供,用于方法學驗證試驗)。

1.2 稀釋溶劑的配制

準確量取甲醇140 mL、二氯甲烷230 mL置于同一試劑瓶中,搖勻,配制得甲醇-二氯甲烷(14∶23, v/v)混合溶液,作為稀釋溶劑,在4 ℃下保存。

1.3 空白溶液的配制

吸取900 μL丙酮置于進樣小瓶中,再加入100 μL稀釋溶劑,渦旋振蕩混勻,作為空白溶劑。

1.4 標準工作溶液的配制

用丙酮將1 000 mg/L的聯氨標準溶液原液逐級梯度稀釋至10、20、40、60、100、120 μg/L,分別吸取上述聯氨標準溶液各100 μL置于不同的進樣小瓶中,再分別加入稀釋溶劑100 μL和丙酮800 μL,渦旋振蕩混勻,即配制得質量濃度分別為1、2、4、6、10、12 μg/L的標準工作溶液。所有標準溶液在4 ℃下保存。

1.5 樣品處理

稱取潑尼松龍樣品1 g置于10 mL具塞離心管中,加入稀釋溶劑至刻度線,渦旋振蕩至樣品完全溶解,配制得100 g/L的樣品測試液。吸取上述配制的樣品測試液100 μL置于進樣小瓶中,再加入丙酮900 μL,渦旋振蕩混勻,即配制得10 g/L的樣品測試液,作為供試品溶液。

1.6 GC-MS/MS分析條件

GC條件:VF-5 MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度250 ℃;載氣為高純He(純度>99.999%);分流進樣,分流比5∶1;進樣量1.0 μL;恒線速度控制模式;柱流量1.0 mL/min;升溫程序為,初始柱溫50 ℃保持1 min, 20 ℃/min升至150 ℃, 30 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

MS/MS條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度280 ℃;溶劑延遲時間2 min;多重反應監測模式(multiple reaction monitoring, MRM);聯氨衍生物的保留時間為3.573 min;定量離子對為m/z112.00>97.10,對應的碰撞能為6 V;定性離子對為m/z112.00>56.10、m/z112.00>70.10,對應的碰撞能為18、9 V。

2 結果與討論

2.1 衍生試劑的選擇

聯氨強極性的氨基基團會與毛細管色譜柱的固定相發生作用,導致色譜峰展寬嚴重,同時還會引起嚴重的柱流失,干擾檢測。聯氨的相對分子質量小,如果直接使用GC-MS/MS進行檢測,易被基質和系統中的其他碎片離子干擾,同時還會因為生成的母離子相對分子質量太小,無法二次打碎生成相應的子離子,無法進行GC-MS/MS分析。此外,聯氨還具有強還原性,理化性質不穩定,在檢測過程中很容易發生氧化反應,使檢測結果失真,甚至還會出現假陰性的結果。所以,在聯氨的GC-MS/MS檢測過程中需引入一種衍生試劑,降低其極性,生成相對分子質量較大且理化性質穩定的衍生產物。目前文獻報道的衍生化試劑有丙酮[18,19]、苯甲醛[2]、對二甲氨基苯甲醛[7]、氯甲酸乙酯[8]、糠醛[9]、鄰苯二甲醛[10]、2-硝基苯甲醛[11]、三氟乙?；猍17]等,其中,由于丙酮為實驗室常用試劑,且價格低廉,有利于本方法的普及和推廣,因此本研究選擇丙酮作為聯氨衍生化試劑,聯氨與丙酮的衍生反應方程式如圖1所示。

圖 1 聯氨與丙酮的衍生化反應Fig. 1 Derivatization reaction between hydrazine and acetone

2.2 色譜-質譜條件的優化

用丙酮將質量濃度為1 000 mg/L的聯氨標準溶液原液稀釋至10 mg/L,然后在m/z60～115范圍內進行全掃描(scan)分析,依次對丙酮和聯氨標準溶液進行檢測。由于丙酮和聯氨衍生物(1,2-二(丙烷-2-亞烷基)肼)的相對分子質量分別為58和112,所以在該條件下,不僅可以完全消除丙酮以及基質中m/z大于115的碎片離子的干擾,同時還能滿足聯氨衍生物的scan分析。圖2為丙酮中干擾雜質和聯氨衍生物總離子流圖的疊加圖,丙酮中有干擾雜質與聯氨衍生物的保留時間一致,干擾聯氨的檢測分析。圖3為丙酮雜質和聯氨衍生物的質譜圖,比較分析發現m/z101的碎片離子同時存在于丙酮雜質和聯氨衍生物的質譜圖中,且強度相近,而m/z97、m/z112的碎片離子只存在于聯氨衍生物質譜圖中,表明m/z101為丙酮基質中干擾雜質的碎片離子,而m/z97、m/z112為聯氨衍生物的特征碎片離子。聯氨衍生物的一級裂解規律如圖4所示。

圖 2 丙酮、聯氨衍生物總離子流圖的疊加圖Fig. 2 Overlap of the total ion chromatograms of acetone and hydrazine derivative

圖 3 (a)丙酮中干擾雜質和(b)聯氨衍生物的質譜圖Fig. 3 Mass spectra of (a) impurity interference in acetone and (b) hydrazine derivative

圖 4 聯氨衍生物的一級裂解規律Fig. 4 First level fragmentation regularity of hydrazine derivative

選取豐度高、質荷比大的特征碎片離子m/z97、m/z112作為母離子(一級碎片離子),進行二級質譜分析,對其進行碰撞能優化,對子離子(二級碎片離子)進行優化選擇,選擇豐度較高、質荷比較大、基質干擾較小的離子對進行定性、定量分析。表1為聯氨衍生物的離子對優化結果,由于丙酮中存在干擾聯氨分析的離子對m/z97.00>56.10(見圖5),所以本方法舍棄該離子對,選取m/z112.00>97.10(定量離子對),以及m/z112.00>56.10、m/z112.00>70.10(定性離子對)對聯氨進行檢測分析。圖6為該條件下空白溶液和供試品溶液的選擇離子流圖,表明空白溶液、供試品溶液中其他組分不會干擾聯氨的檢測分析,該方法專屬性良好。再對分流比、升溫程序、柱流量、進樣口溫度、接口溫度等色譜參數進行優化調整,使聯氨衍生物的響應和峰形均達到最佳,縮短方法檢測程序的時間,提高檢測效率。聯氨衍生物的二級裂解規律如圖7所示。

表 1 聯氨衍生物的離子對

圖 5 丙酮的選擇離子流圖Fig. 5 Selected ion chromatogram of acetone

圖 7 聯氨衍生物的二級裂解規律Fig. 7 Second level fragmentation regularity of hydrazine derivative

2.3 溶劑體系的優化

平行稱取10份潑尼松龍樣品100 mg于離心管中,分別加入水、甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、正己烷、乙酸乙酯、甲苯各1 mL,充分渦旋振蕩,考察樣品的溶解情況。發現除N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜能完全溶解,乙腈能部分溶解外,其他溶劑的溶解效果均不理想。同時對聯氨衍生物在N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈體系中的響應情況進行考察,發現聯氨衍生物在乙腈體系中的色譜峰嚴重前延,在N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜體系中響應很低,且峰形不佳。

上述實驗結果表明,使用單一溶劑難以同時實現樣品溶解和聯氨衍生物響應良好,因此,本研究嘗試使用混合溶劑體系來解決樣品的溶解和目標物質響應的問題。研究發現,采用甲醇-二氯甲烷混合溶劑時,潑尼松龍的溶解有很大改善。甲醇、二氯甲烷體積比在11∶29至22∶18范圍內時,100 mg潑尼松龍能完全溶于1 mL甲醇-二氯甲烷混合溶劑;當甲醇、二氯甲烷體積比為14∶23時,潑尼松龍的溶解度最好。綜上,本研究先采用甲醇-二氯甲烷(14∶23, v/v)作為稀釋溶劑來溶解潑尼松龍樣品,再用丙酮將其稀釋10倍,即最終的溶劑體系為丙酮-稀釋溶劑(9∶1, v/v)。在該溶劑體系下,聯氨標準溶液(6.00 μg/L)的選擇離子流圖如圖8所示,聯氨衍生物色譜峰響應、峰形均良好。

圖 8 6.00 μg/L聯氨標準溶液的選擇離子流圖Fig. 8 Selected ion chromatograms of 6.00 μg/L hydrazine standard solution

2.4 衍生化條件的優化

文獻[18,19]報道,當采用丙酮作為衍生化試劑檢測聯氨時,需添加冰乙酸和在超聲條件下進行衍生化反應。本研究從超聲時間和冰乙酸添加量兩方面對衍生化條件進行優化。首先配制冰乙酸含量為1 mL/L的丙酮溶液,再用該溶液按1.4節方法配制質量濃度為6.00 μg/L的聯氨標準溶液,將該溶液平行分裝成8份置于進樣小瓶中,分別超聲處理0、1、2、5、10、15、30、60 min后,分析聯氨標準溶液定量離子對m/z112.00>97.10峰面積的變化趨勢(見圖9a)。超聲時間在0～60 min范圍內時,聯氨標準溶液的峰面積穩定,聯氨的衍生反應與超聲時間的長短沒有關系。分別配制冰乙酸質量濃度為0、1、2、5、10、25 mL/L的丙酮溶液,再按1.4節方法分別配制6.00 μg/L的聯氨標準溶液,不同冰乙酸濃度體系下,聯氨標準溶液定量離子對m/z112.00>97.10峰面積的變化趨勢如圖9b所示。當冰乙酸質量濃度為0～5 mL/L時,聯氨標準溶液峰面積穩定;當冰乙酸濃度為5～25 mL/L時,隨著冰乙酸濃度的增加,聯氨標準溶液峰面積有逐漸減小的趨勢,表明聯氨的衍生化反應不需要在添加冰乙酸的條件下進行。上述結果表明,聯氨與丙酮混合后可直接發生衍生化反應,該反應不需要添加冰乙酸,也不需要在超聲條件下進行。

圖 9 (a)不同超聲時間和(b)乙酸濃度下的聯氨標準溶液的峰面積(m/z 112.00>97.10)Fig. 9 Peak areas of hydrazine (m/z 112.00>97.10) in standard solutions with (a) different ultrasonic time and (b) acetic acid concentrations

2.5 方法檢出限、定量限和線性范圍

用優化好的方法依次分析按照1.4節配制的標準工作溶液,以聯氨衍生物定量離子對m/z112.00>97.10的峰面積(y)和聯氨質量濃度(x, μg/L)進行線性回歸,聯氨在1～12 μg/L范圍內線性關系良好,得到線性回歸方程y=811.41x+56.43和線性相關系數r2=0.999 9。分別以10倍信噪比(S/N)和3倍S/N確定聯氨的方法定量限和檢出限為0.10和0.03 mg/kg。結果表明本方法適用于潑尼松龍中痕量聯氨的檢測分析。

2.6 進樣精密度

按1.4節配制6.00 μg/L的聯氨標準溶液,連續測定6次,以聯氨衍生物定量離子對m/z112.00>97.10峰面積的RSD值考察方法的進樣精密度。6次峰面積的RSD值為1.10%,表明本方法進樣精密度良好。

2.7 加標回收率和重復性

對潑尼松龍市售標準品和某藥企提供的9個不同批次的潑尼松龍樣品進行檢測分析,均未檢出聯氨殘留。配制加標質量濃度分別為1、6、12 μg/L的低、中、高水平空白加標樣品溶液,每個加標水平平行制備6份樣品進行檢測。結果如表2所示,不同加標水平下,聯氨的平均回收率為96.15%～96.46%, RSD值為1.77%～2.12%,能滿足聯氨的檢測要求。

表 2 聯氨的加標回收率和重復性(n=6)

2.8 中間精密度

不同時間、不同人員分別平行配制6份加標水平為6 μg/L的空白加標樣品溶液,在同一臺儀器上重復測定,12次測定的平均加標回收率為96.23%, RSD值為1.77%,表明本方法的中間精密度良好。

2.9 方法的耐用性

本方法通過改變色譜條件來研究檢測結果受影響的程度。分別在原條件、初始柱溫±5 ℃、升溫速率±2 ℃/min、柱流量±0.1 mL的條件下檢測6.00 μg/L的聯氨標準溶液和6 μg/L的空白加標樣品溶液,外標法單點計算加標回收樣品溶液中聯氨的含量,結果如表3所示。聯氨檢測結果的RSD值為2.58%,表明本方法耐用性良好,色譜條件的適當改變不會對檢測結果造成太大影響。

表 3 聯氨檢測方法的耐用性

3 結論

本研究建立了衍生化-GC-MS/MS測定潑尼松龍中聯氨的分析方法。樣品先經甲醇-二氯甲烷(14∶23, v/v)溶解,再經丙酮稀釋、衍生后,直接上機檢測分析。該方法操作簡便、專屬性強、檢出限低、準確度高、基質干擾小、基質效應低、耐用性好,能夠滿足潑尼松龍中聯氨的檢測要求,為潑尼松龍及其他藥物中聯氨的檢測及監控提供了科學依據和技術支持。