全糯性小麥濟糯116的籽粒蛋白質組學分析

韓冉，毛鳳鑫，程敦公，李豪圣，劉建軍，曹新有，宋健民，辛明明，郭軍，劉成，劉愛峰

（1.山東省農業科學院作物研究所／農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.中國農業大學農學院，北京 100193）

小麥籽粒淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，淀粉的合成主要由可溶性淀粉合成酶和顆粒結合淀粉合成酶負責。其中顆粒結合淀粉合成酶與直鏈淀粉的合成密切相關，該酶又稱Wx蛋白。六倍體普通小麥含有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三種Wx蛋白亞基，分別由位于染色體7AS、4AL和7DS上的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1基因編碼。同時含有3個Wx蛋白亞基基因的小麥為普通小麥；缺失1或2個Wx蛋白亞基基因的突變體稱為部分糯小麥［1，2］；同時缺失3個Wx蛋白亞基基因的突變體稱為糯性小麥［3，4］。糯小麥具有獨特的高支鏈淀粉和麥谷蛋白，加工特性獨特，營養品質好，是一種新食品開發的優質原糧。

糯小麥是一種新小麥類型，籽粒貯存淀粉中支鏈淀粉含量≥99%。目前，對于糯小麥的研究主要集中于加工品質、淀粉結構特征、貯藏淀粉合成機制等方面［5-8］。雖然六倍體小麥中的3個Wx基因已被克?。?］，但這些基因尚不能完全解釋小麥淀粉糯性變異的機制［10，11］。本研究利用TMT（tandem mass tags）定量蛋白質組學技術，結合小麥最新基因組（iwgsc＿refseqv1.0 2018）注釋信息［12］和UniProt蛋白數據庫［13］，快速高通量地鑒定2個糯性不同小麥種子中蛋白差異表達情況，并通過生物信息學分析方法，對差異表達蛋白進行功能和通路等富集分析，以期挖掘影響籽粒糯性的潛在新基因，為小麥品質改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全糯性小麥品種濟糯116（JN116）由山東省農業科學院作物研究所培育，其Wx蛋白的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1亞基均為缺失突變型，支鏈淀粉含量接近100%。以非糯性小麥品種濟麥22（JM22）為對照。供試材料種植于山東省農業科學院濟南試驗基地，收獲后選取飽滿一致的籽粒保存于-80℃備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子蛋白提取 稱取適量籽粒樣品至預冷的研缽中，研磨至粉末，加入4倍體積酚抽提緩沖液（1%蛋白酶抑制劑和2 mmol／L EDTA，10 mmol／L二硫蘇糖醇），超聲裂解。加入等量的Tris平衡酚，5 500×g、4℃離心10 min，加入5倍的0.1 mol／L乙酸銨／甲醇沉淀12 h，分別用甲醇和丙酮進行洗滌。用8 mol／L尿素溶解后利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2 胰酶酶解 在蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇，濃度調至5 mmol／L，在56℃下放置30 min。加入碘代乙酰胺使其濃度為11 mmol／L，室溫黑暗環境培養15 min。然后將樣品的尿素濃度稀釋至2 mol／L以下。按照1∶50的質量比例（胰蛋白酶∶蛋白）加入胰蛋白酶，37℃消化過夜。然后以1∶100的質量比例（胰酶∶蛋白）加入胰蛋白酶并繼續酶解4 h。

1.2.3 高效液相色譜（HPLC）分級及液相色譜-質譜聯用分析 肽段用高pH反向HPLC分級，然后注入到NSI離子源中進行電離，再進入Orbitrap Fusion Lumos質譜進行分析。該試驗由杭州景杰生物科技有限公司完成。

1.3 數據分析

1.3.1 差異蛋白篩選 將各個樣本的相對定量值取log2（以使得數據符合正態分布），然后用雙樣本雙尾t檢驗方法計算兩個樣本中蛋白的差異表達顯著性（P值）。當P＜0.05時，以差異表達倍數變化超過1.5作為顯著上調的變化閾值，小于0.67作為顯著下調的變化閾值。

1.3.2 差異蛋白的注釋及功能分析 利用Uni-Prot-GOA數據庫 （http://www.ebi.ac.uk/GOA/）進行GO蛋白質組注釋。Wolfpsort（https://wolfpsort.hgc.jp/）用于預測差異表達蛋白的亞細胞定位。根據KEGG網站（http://www.genome.jp/kegg/）分類注釋KEGG通路。采取聚類分析法研究差異蛋白在KEGG通路、蛋白結構域和GO等特定功能上的差異以及關聯性［14］。

2 結果與分析

2.1 小麥籽粒蛋白鑒定

測序結果顯示：濟糯116共獲得5 423個蛋白，濟麥22共獲得5 417個，根據蛋白質豐度水平差異倍數為1.5以上且P＜0.05的條件對濟糯116和濟麥22籽粒質譜鑒定獲得的蛋白進行篩選，共獲得161個差異表達蛋白，其中上調蛋白59個、下調蛋白102個（圖1）。

圖1 濟糯116和濟麥22差異表達蛋白定量火山圖

2.2 差異蛋白的亞細胞定位

對差異蛋白進行亞細胞定位發現，差異蛋白主要集中在葉綠體中，其次為細胞質和細胞外。細胞外下調蛋白數目（25）遠大于上調蛋白數目（4）；在葉綠體、細胞核、液泡和線粒體中，下調蛋白的數目也大于上調蛋白的數目（表1）。

表1 差異表達蛋白的亞細胞結構定位分布

2.3 差異表達蛋白的GO和KEGG分析

對2個小麥品種中鑒定出的161個差異蛋白進行GO富集分析，結果（表2）表明，在生物學過程中，差異蛋白基因主要富集在代謝過程（metabolic process，56）、細胞過程（cellular process，44）及單一細胞生物進程（single-organism process，43）；單一細胞生物進程、生物調節（biological regulation）、對刺激的反應（response to stimulus）及定位（localization）中下調蛋白數目多于上調蛋白。在細胞組成中，差異蛋白基因主要富集在細胞（cell，29）、細胞器（organelle，20）中。在分子功能中，差異蛋白基因主要富集在催化活性（catalytic activity，56）和結合（binding，48）中。在細胞組成和分子功能中，胞外區（extracellular region）、分子功能調節（molecular function regulator）及營養儲存庫活性（nutrient reservoir activity）中下調蛋白的數目遠大于上調蛋白，其中營養儲存庫活性的差異蛋白為醇溶蛋白、谷蛋白、燕麥蛋白等種子貯存蛋白（表3）。

表2 差異表達蛋白在GO二級分類中統計分布

在分子功能中，GO富集分析（圖2）發現淀粉合成酶活性類［glycogen（starch）synthase activity］的蛋白差異倍數最大，其次為核糖體RNA N-糖基化酶活性類（rRNA N-glycosylase activity）和RNA糖基化酶活性類（RNA glycosylase activity）蛋白；酶調控活性類（enzymeregulatoractivity）和分子功能調控類（molecular function regulator）的蛋白數目較多，其次為酶抑制活性（enzyme inhibitor activity）、營養儲存庫活性（nutrient reservoir activity）等。

KEGG是連接已知分子間相互作用的信息網絡，如代謝通路、復合物、生化反應等。通過KEGG富集，161個差異蛋白中有36個差異蛋白富集到13個代謝途徑中。顯著富集的有4條代謝途徑（表4），包括核糖體（ribosome）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、氮代謝（nitrogen metabolism）和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（alanine，aspartate and glutamate metabolism）。其中核糖體代謝途徑中包含10個差異表達蛋白，這些蛋白均上調表達；淀粉和蔗糖代謝途徑中有8個差異表達蛋白，其中6個上調，2個下調；氮代謝途徑中包含3個下調蛋白；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝中包含4個下調蛋白。

表3 營養儲存庫活性類相關差異表達蛋白

圖2 差異表達蛋白在GO功能分類中的分子功能富集分布氣泡圖

2.4 蛋白結構域富集分析

對于差異表達蛋白的結構域進行富集分析（圖3）發現，上調蛋白質與淀粉合酶、催化結構域（starch synthase，catalytic domain）、核糖體蛋白L7Ae／L30e／S12e／Gadd45（ribosomal protein L7Ae／L30e／S12e／Gadd45）、50S核糖體蛋白L30e-樣（50S ribosomal protein L30e-like）、糖基轉移酶家族1（glycosyltransferase，family 1）有關。下調的差異蛋白與雙功能抑制劑／植物脂質轉移蛋白／種子存儲螺旋結構域（bifunctional inhibitor／plant lipid transfer protein／seed storage helical domain）及雙功能胰蛋白酶／α-淀粉酶抑制劑螺旋結構域（bi-functional trypsin／alpha-amylase inhibitor helical domain）等有關。

圖3 濟糯116與濟麥22差異表達蛋白的蛋白質結構域富集分析

2.5 與淀粉合成相關的差異蛋白

通過KEGG分析發現淀粉和蔗糖代謝通路（starch and sucrose metabolism）中所涉及到的差異基因有8個，2個為下調蛋白（圖4綠色部分），其登錄號為A0A1D6BU17和Q9FUU6；6個為上調蛋白（紅色部分），分別為A0A1D6BW01、A0A341XU21、Q2WGB1、A0A341V6U2、A0A341VM83、A0A1D5U5L3，其中A0A1D6BW01、A0A341XU21和Q2WGB1為淀粉合成酶（starch synthase）；A0A341V6U2、A0A341VM83為α-1，4葡聚糖磷酸化酶L同工酶（alpha-1，4 glucanphosphorylase L isozyme）；A0A1D5U5L3為1，4-α-葡聚糖分支酶（1，4-alpha-glucan-branching enzyme）（表4）。

3 討論與結論

種子發育和成熟的過程也是貯藏物質逐漸累積的過程［15］。種子內的貯藏物質主要是蛋白質、脂肪、糖類及其他含氮物。本研究利用TMT技術對糯性小麥濟糯116和非糯性小麥濟麥22的成熟籽粒進行蛋白組分析，共獲得161個差異表達蛋白，其中上調蛋白59個，下調蛋白102個。對差異蛋白進行亞細胞定位發現，位于葉綠體的差異蛋白數目最多。對差異蛋白進行功能分析表明，參與淀粉合成的蛋白差異倍數最大，這與兩個供試品種在淀粉組成上存在較大差異有關。另外，核糖體代謝途徑及淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異蛋白最多，表明除淀粉和蔗糖代謝外，核糖體代謝也可能參與小麥糯性機制。

貯藏蛋白多存在于胚乳，包括麥谷蛋白、醇溶蛋白、燕麥蛋白、球蛋白等。貯藏蛋白與營養品質及食品加工品質密切相關［16］。差異蛋白分析發現營養儲存庫活性類相關差異表達蛋白包含多種貯藏蛋白（表3），其中P10387（高分子量麥谷蛋白亞基DY10）和A0A1D5S346（γ-醇溶蛋白）的表達量上調，表明濟糯116籽粒中γ-醇溶蛋白和DY10的蛋白含量高于濟麥22。但α-醇溶蛋白（A0A0K2QJX7、J7HT09、A0A0E3Z6M6、I0IT52和A0A0E3Z7G8）、燕麥蛋白（A0A1D6DC72和A0A341XLT1）等蛋白的含量低于濟麥22。

圖4 淀粉合成通路中的差異蛋白

貯藏蛋白的生物合成依賴于氨基酸的合成和氮代謝［17］。谷氨酰胺與谷氨酸是氨基酸生物合成的基礎物質，而谷氨酰胺合成酶（GS）在銨基轉換為谷氨酰胺和谷氨酸的過程中發揮重要作用［18］。本研究發現差異蛋白中參與氨基酸代謝和氮代謝的蛋白均下調表達，且谷氨酰胺合成酶（Q6RUJ0）的表達量也下調。這表明在種子成熟后，濟糯116的貯藏蛋白合成量低于濟麥22。

在造粉體內，淀粉的合成是由ADPG焦磷酸化酶（EC 2.7.7.27）、淀粉合成酶（EC 2.4.1.21）、顆粒結合型淀粉合成酶（EC 2.4.1.242）、淀粉分支酶（EC 2.4.1.18）和淀粉去分支酶（EC 2.4.1.41）等多種酶協同作用，通過復雜的途徑完成的［19］。其中淀粉分支酶是引入α-1，6分支鍵的唯一酶，在支鏈淀粉合成中起著重要作用，并與其他淀粉合成酶一起完成對淀粉多聚體的精細修剪［20］。顆粒結合型淀粉合成酶（EC 2.4.1.242）與淀粉粒特異性結合，使合成的直鏈淀粉保持未分支狀態。本研究對糯性小麥濟糯116和非糯性小麥濟麥22蛋白組學比較發現淀粉分支酶（EC 2.4.1.18）的量上調，上調比率為1.810（A0A1D5U5L3）；而顆粒結合型淀粉合成酶的量下調，下調比率分別為0.229（A0A1D6BU17）和0.308（Q9FUU6）。濟糯116的Wx蛋白的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1亞基均缺失，這是導致顆粒結合型淀粉合成酶的量下調及支鏈淀粉含量上升的主要原因。除此以外，淀粉分支酶量的增加也是導致支鏈淀粉含量增加的一個原因。