小麥鹽脅迫持續上調轉錄因子基因TaERF8-2D的克隆及其分析

崔德周，李永波，隋新霞，黃琛，楊在東，樊慶琦，楚秀生，3

（1.山東省農業科學院作物研究所／農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.山東魯研農業良種有限公司，山東 濟南 250100；3.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014）

鹽脅迫是制約農業發展的全球性問題。據統計，全球約8.3億公頃的耕地遭受著土壤鹽漬化的侵蝕［1］。我國鹽堿地總面積約為3 600萬公頃，鹽脅迫每年造成的糧食減產達總產的15%以上［2］。小麥是我國主要糧食作物之一，也是鹽漬化土壤重要的栽培作物，其耐鹽性的高低直接決定是否能夠穩產、高產。因此克隆小麥耐鹽基因，解析其對鹽脅迫的響應機制，對小麥耐鹽遺傳改良具有重要意義。

轉錄因子是生物體內一類重要的調節蛋白，它們通過與啟動子區域的順式作用元件發生特異性結合，直接調控下游靶基因的表達［3］。AP2／EREBP（APETALA 2／ethylene-responsive element binding protein）類轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子，因含有AP2／EREBP結構域而得名。在擬南芥中，Sakuma［4］和張麒［5］等根據其序列相似性和AP2／EREBP結構域的數量，將其分為AP2（APETALA 2）、RAV（related to ABI3／VP1）和EREBP（ethylene-responsive element binding protein）三大類型。EREBP型轉錄因子根據其在DNA結合區第14位和第19位的氨基酸序列差異，又可分為DREB（dehydration-responsive element binding protein）亞族和ERF（ethylene-responsive factor）亞族，其中DREB亞族第14位和第19位分別是纈氨酸和谷氨酸，而ERF亞族則是丙氨酸和天冬氨酸［4］。隨著基因組學和高通量測序技術的發展，擬南芥、水稻、黃瓜、苜蓿等多種植物中ERF亞族的系統鑒定與分析被陸續報道［6-9］。

ERF類轉錄因子在植物生長發育、信號轉導及逆境響應中發揮重要作用［5，10，11］。擬南芥ERF109通過介導茉莉酸信號轉導和生長素合成通路間的交互作用，調控側根的發生［12］。過表達蘋果ERF3基因可促進花青苷和原花青苷的積累［13］。大豆ERF3基因可被高鹽、干旱等誘導表達，將其在煙草中過表達后，可顯著提高煙草對高鹽和干旱脅迫的耐受能力［14］。普通小麥中ERF類轉錄因子成員有47個［15］，主要參與應答生物或非生物逆境脅迫，然而，目前僅有少數幾個ERF基因被克隆，并進行相應的研究。研究表明，小麥ERF1基因的表達受高鹽、干旱、低溫、ABA、乙烯、水楊酸以及白粉病菌侵入的誘導［16］；Zhu等克隆了受病原菌誘導的TaPIE1（pathogeninduced ERF1）基因，發現該基因的表達受紋枯病菌和低溫脅迫共同誘導［17］；TaERF3基因除應答高鹽和干旱脅迫外，對病原菌侵入和外源激素處理也有響應［18，19］；TaERF4基因在擬南芥中通過抑制液泡膜NHX活性，負調控耐鹽性［20］；TaERF8-2B在調控普通小麥株高、抽穗期和千粒重中發揮重要作用［21］，而TaERF8-2A和TaERF8-2D基因雖已被克隆，但尚未對其功能進行解析，更未有在耐鹽小麥品種中進行基因功能分析的報道。

本研究利用本團隊獲得的耐鹽小麥轉錄組數據，從耐鹽小麥品種德抗961中克隆了鹽脅迫下持續上調的基因TaERF8-2D，并對其進行了生物信息學分析、亞細胞定位和鹽脅迫下的基因表達分析，以期為深入研究該基因在小麥鹽脅迫中的耐鹽功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用耐鹽小麥品種為德抗961，由山東省農業科學院作物研究所小麥種質創新與利用團隊保存。

1.2 TaERF8-2D基因克隆及生物信息學分析

利用本團隊獲得的耐鹽小麥品種德抗961的轉錄組EST數據，通過Ensembl小麥基因組數據庫進行比對，使用Primer Premier 5.0軟件設計獲得特異引物（F：5′-ATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′；R：5′-TCACGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′），以德抗961幼苗葉片cDNA為模板，擴增TaERF8-2D基因的CDS序列。PCR擴增程序：95℃5 min；95℃30 s，50℃30 s，72℃45 s，35個循環；72℃10 min；16℃，保存。膠回收后的DNA，連接到pEASY-Blunt Cloning Kit（全式金，北京），并轉化大腸桿菌Trans5α（全式金，北京）。挑選陽性克隆，送北京擎科新業生物技術有限公司（青島）進行測序。

利用ExPASy-ProtParam（http://www.expasy.org／tools／protparam.html）和ProtScale（https://web.expasy.org／protscale／）分別分析TaERF8-2D蛋白的理化性質和親疏水性。使用SignalP 5.0在線工具（http://www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進行信號肽預測。采用TMHMM 2.0在線軟件 （http://www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM-2.0／）預測TaERF8-2D蛋白的跨膜結構。通過NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）在線預測分析蛋白的磷酸化位點。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝npsa＿sopma.html）對編碼蛋白的二級結構進行預測。

1.3 亞細胞定位分析

設計帶有XbaⅠ和SalⅠ酶切位點的特異性引物 （F：5′-GCTCTAGAATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′；R：5′-ACGCGTCGACCGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′），擴增無終止密碼子的TaERF8-2D全長CDS片段，經雙酶切后，連接到表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP，并轉化大腸桿菌Trans5α，然后篩選陽性克隆。將重組質粒轉化農桿菌GV3101，鑒定陽性克隆并保存。將重組質粒和對照空載體分別轉化擬南芥原生質體，室溫培養過夜，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察原生質體中綠色熒光的分布情況。

1.4 鹽脅迫下的基因表達分析

將室溫22℃、光照培養10 d的德抗961小麥幼苗置于250 mmol／L NaCl溶液中進行脅迫處理，分別在處理0、3、6、12、24 h和48 h時取第一片展開葉片，液氮速凍后，于-80℃保存備用。

按照植物組織RNA快速提取試劑盒（天根生化，北京）提取小麥葉片總RNA。采用反轉錄試劑盒（全式金，北京）合成cDNA第一鏈。利用TaERF8-2D基因的特異引物［21］（F：5′-CGACAGATTGCAGCAACAACAACAGTG-3′；R：5′-CCCGTTGTGCCTGAGCTCGATATA-3′）和Tubulin內參引物（F：5′-TCGATGA TCTCCAACTCCACCAGT-3′；R：5′-TCGTCGAACTCAGCACCAACTTCT-3′）進行RT-PCR。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產物。

2 結果與分析

2.1 小麥TaERF8-2D基因的克隆

以耐鹽小麥德抗961的cDNA為模板，經PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，在750 bp左右出現一個特異DNA條帶（圖1）。通過對其回收和測序，發現該片段長度為762 bp，編碼253個氨基酸。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 TaERF8-2D編碼蛋白的二級結構分析利用SOPMA網站對該基因編碼蛋白的二級結構進行分析，結果表明，該編碼蛋白二級結構中無規則卷曲比例最高，占68.39%，α-螺旋占19.76%，延伸鏈占8.30%，β-轉角占3.56%（圖2）。

2.2.2 蛋白理化性質分析 通過ExPASy-Prot-Param分 析，TaERF8-2D蛋 白 的 分 子 式 為C1176H1845N353O365S6，分子量為26.96 kD，理論等電點（pI）為9.55，不穩定系數為57.39，推測該蛋白為不穩定蛋白。對該蛋白的親水性、疏水性進行分析表明，其總平均吸水性為-0.521，屬于親水蛋白（圖3）。

2.2.3 蛋白信號肽預測 利用SignalP 5.0和TMHMM 2.0在線預測表明，該蛋白既無信號肽，也不存在跨膜結構域（圖4），由此推斷該蛋白不是分泌蛋白。

圖2 TaERF8-2D蛋白的二級結構

圖3 TaERF8-2D蛋白的親水性和疏水性預測

圖4 TaERF8-2D信號肽（A）及跨膜結構域（B）分析

2.2.4 氨基酸磷酸化修飾位點分析 使用在線軟件NetPhos 3.1對TaERF8-2D蛋白的磷酸化位點進行分析，結果表明，該蛋白共有30個氨基酸磷酸化位點，其中絲氨酸（Ser）磷酸化位點最多，有16個；其次為蘇氨酸（Thr），磷酸化位點有13個；而酪氨酸（Tyr）磷酸化位點僅有1個（圖5）。

圖5 TaERF8-2D蛋白的氨基酸磷酸化位點分析

2.3 亞細胞定位

將含有重組載體pCAMBIA2300-35S：：TaERF8-2D-GFP和對照空載體pCAMBIA2300-35SGFP的菌液，利用瞬時轉染法導入擬南芥原生質體，25℃暗培養24 h后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。結果顯示，TaERF8-2D：：GFP融合蛋白僅在細胞核有明顯的綠色熒光，而對照空載體在細胞膜、細胞核和細胞質中都可以觀察到綠色熒光信號，由此表明，編碼的TaERF8-2D蛋白定位于細胞核（圖6）。這與報道的ERF類轉錄因子主要定位于細胞核的結論相一致［22，23］，主要參與細胞核內轉錄調控過程。

圖6 TaERF8-2D蛋白的亞細胞定位

2.4 鹽脅迫下TaERF8-2D基因的表達分析

利用RT-PCR檢測TaERF8-2D基因對鹽脅迫的響應特性。結果顯示，在鹽脅迫24 h和48 h時，該基因的表達顯著增強（圖7），進一步證明TaERF8-2D基因可能與小麥鹽脅迫的響應密切相關。

圖7 TaERF8-2D基因響應鹽脅迫的RT-PCR分析

3 討論與結論

ERF類轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子，廣泛參與植物發育、代謝和抗逆過程［5，10-14］，是改良植物遺傳特性的優異基因資源。ERF類轉錄因子主要參與逆境脅迫響應和生長發育，在眾多的ERF類轉錄因子成員中，僅有少數幾個ERF基因從普通小麥中被克隆出來［16，18-21，24］。本研究利用本團隊獲得的耐鹽小麥轉錄組及其基因表達數據，從耐鹽小麥品種中篩選到對鹽脅迫響應非常明顯的基因TaERF8-2D。而有關TaERF8-2D基因編碼的蛋白信息以及該基因對小麥鹽脅迫的響應尚未見報道，因此明確該基因編碼蛋白質的特性、亞細胞定位以及鹽脅迫下的基因表達模式，對于進一步探究該基因的耐鹽功能具有重要意義。

蛋白質的理化特性、亞細胞定位與其生物學功能密切相關。本研究結果表明，小麥TaERF8-2D基因編碼的蛋白質屬于親水蛋白，沒有信號肽且不存在跨膜結構域，不屬于分泌蛋白，該蛋白定位于細胞核，這與大多數轉錄因子的定位信息相一致［22］。蛋白質磷酸化作為一種重要的翻譯后修飾，是調控蛋白質活力和功能的重要機制，廣泛參與細胞信號轉導、抗逆脅迫等多種生物過程［25］。本研究表明，TaERF8-2D蛋白共有30個氨基酸磷酸化位點，推測TaERF8-2D基因可能經過蛋白磷酸化修飾后，行使其響應鹽脅迫等逆境脅迫的生物學功能。

前人研究表明，ERF類轉錄因子在響應植物鹽脅迫方面扮演重要角色。本研究RT-PCR結果表明，鹽脅迫處理后，TaERF8-2D表達被顯著誘導，這與OsERF103、GmERF3、TaERF1、TaERF3等ERF類轉錄因子表達趨勢相似［14，16，19，26］，暗示TaERF8-2D基因在小麥鹽脅迫響應過程中可能發揮重要作用，但其具體調控機制仍有待于進一步研究。