面包面條優質小麥轉錄組學分析

巨偉，王紅日，薛春芝，龐亞男，吳德豪，郭憲峰，程敦公，韓冉，劉愛峰，李豪圣，劉建軍，曹新有，宋健民，訾妍

（1.山東省農業科學院作物研究所，山東 濟南 250100；2.山東魯研農業良種有限公司，山東 濟南 250100；3.菏澤市牡丹區種子資源開發保護中心，山東 菏澤 274000）

轉錄組測序是解析生物經濟性狀形成分子機制、發掘基因資源的重要手段之一［1］，該技術為差異基因表達分析、功能基因和轉錄因子挖掘、等位基因特異性表達研究等提供了新的手段，尤其是對全面解析復雜性狀的遺傳調控網絡非常有效，已成功應用于水稻、玉米、小麥、黃瓜、黃豆、番茄等多種作物研究。因此，獲得高質量的轉錄組對于作為重要糧食作物之一的小麥具有重要的研究意義。近年來，針對小麥抗旱、耐熱、抗病等性狀進行了一些轉錄組研究，篩選出部分目的基因，并對篩選到的基因進行了深入分析［2-5］。

小麥食品加工品質是決定其生產應用和市場競爭力的關鍵因素，小麥品質主要受蛋白、淀粉等籽粒主要成分理化特性的控制，而蛋白和淀粉的合成受一系列基因和調控因子的復雜網絡調控，因此利用RNA-Seq技術構建不同面包、面條品質類型典型品種籽粒轉錄組文庫，篩選差異表達基因，發掘調控面包、面條品質的關鍵基因和調控因子，解析小麥品質形成的生理代謝機制和調控網絡，對于指導我國小麥品質遺傳改良具有重要意義。小麥品質性狀非常復雜，過去研究多局限于單一或個別性狀的影響和調控分析，研究方法也多是統計分析，很少在全基因組水平全面解析小麥品質的遺傳調控網絡。RNA-Seq技術的發展，為從轉錄組水平全面解析小麥品質遺傳調控提供了可能。Yu等［6］通過動態轉錄組分析，鑒定出8個對淀粉與蛋白質合成以及壓力脅迫響應相關的基因。利用我們前期研究中篩選出的6類有代表性的小麥材料：面包優質小麥、面包劣質小麥、面條優質小麥、面條劣質小麥、面包和面條兼優小麥、面包和面條均劣小麥各2份，本研究利用RNA-Seq技術分析了其灌漿不同時期（開花后7、17、27 d）的基因表達情況，以期篩選調控面包、面條品質性狀的差異基因和調控因子，結合蛋白和淀粉理化特性篩選關鍵基因進行qRT-PCR驗證，這對全面解析小麥品質遺傳調控網絡、促進小麥品質遺傳改良具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與種植方法

供試品種為6類12個小麥品種，分別是面包優質小麥（GB）JM4072、ZM12，面條優質小麥（GN）JM19、ZM18，面包劣質小麥（BB）TN18、QF1，面條劣質小麥（BN）LM1、LM19，面包面條均優小麥（GBN）JM20、ZM366，面包面條均劣小麥（BBN）LM14、XM18。

試驗于2014—2016年在山東省農業科學院實驗站（36°42′N、117°05′E）進行。試驗采用隨機區組設計，播種密度為3×106株／hm2，行距25 cm，小區面積6 m2（4.0 m×1.5 m），重復3次。2014年10月和2015年10月播種，2015年6月和2016年6月收獲，均按高產田常規栽培措施管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集及RNA提取、純化 分別于花后7、17、27 d取同一天開花的小穗中部籽粒，送至廣州基迪奧生物科技有限公司，利用Trizol法提取總RNA，采用DNaseⅠ（RNase-free）消化所得RNA樣本中的殘余DNA。

1.2.2 轉錄組測序 樣品提取總RNA后，經富集、打斷、六堿基隨機引物（random hexamers）合成、末端修復、加堿基A、加測序接頭、PCR擴增等過程制備測序文庫，構建好的文庫用Illumina-HiSeqTM進行測序。

1.2.3 RNA-Seq質量評估和序列比對 在全部測序結果中選擇錯誤率小于1%的用于后續轉錄組分析，更嚴格過濾得到high quality clean reads，同時計算Q20和Q30。小麥參考基因組從http://www.wheatgenome.org／下載，選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進行基因組定位分析。樣本之間（包括3個生物學重復）的基因表達水平則采用皮爾遜相關性檢測進行分析。

1.2.4 差異基因篩選 將同一類型的兩個品種作為一組，進行不同組間小麥品種的差異基因分析?；虮磉_量的計算采用FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped reads）法［7］。使用DESeq R軟件包（1.18.0）［8］對不同類型小麥之間的差異表達基因進行研究。當FDR校正后的p值＜0.05且時則認為該基因表達差異顯著。

1.2.5 GO注釋和KEGG分析 Gene Ontology（簡稱GO，http://www.geneontology.org／）富集分析采用軟件為GOseq［9］，GO分為分子功能（molecular Function）、生物過程（biological process）和細胞組成（cellular component）三個部分。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp／）是系統分析基因功能、基因組信息數據庫，分析內容包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機物的生物降解［10］。

1.2.6 qRT-PCR驗證 為了驗證RNA-Seq檢測出的基因表達水平是否正確，從RNA-Seq測序用總RNA中取出1μg用于qRT-PCR實驗。使用Primer Premier 5軟件進行引物設計，引物序列由擎科生物技術有限公司合成，釆用PAGE純化（表1）。

使用羅氏公司的LightCycler 480Ⅱ進行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應體系10μL包括：2×SYBR Premix Ex TaqⅠ5μL，正向引物與反向引物各0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL。PCR程序為：95℃1 min預變性；40×（95℃15 s，55℃15 s，72℃15 s）收集熒光信號；95℃1 s，60℃1 s，95℃1 s，37℃1 s為熔解曲線階段。采用2-ΔΔCt法［11］分析目的基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 測序結果質量評估

對原始數據進行數據過濾去除大量的測序接頭序列、低質量的讀段、序列N的比例大于10%的reads，最終得到2 882 357 526條clean reads，每個樣本測序量超過10 G，達到文庫采樣深度的要求。質量達到Q30級別的堿基占總堿基數的84%以上（表2）。51%以上的reads可以比對到參考基因組上，50%以上的reads能夠比對到唯一轉錄本上，2%左右的reads可比對到多個轉錄本上。且reads打斷隨機性好，在參考基因組各個位置分布均勻。比對到唯一轉錄本的reads可以用來進行下一步的分析工作。

表2 RNA-Seq測序結果質量評估

2.2 不同類型面包、面條小麥不同時期差異表達基因的分析

為了鑒別6類不同加工品質小麥的差異表達基因（DEGs），對組間基因表達量進行了比對分析。以同期GB小麥為對照，花后7 d共找到4 529個差異表達基因，其中有2 549、1 980個基因表達量分別呈上調和下調；花后17 d共找到3 198個差異表達基因，其中有1 775、1 423個基因表達量分別呈上調和下調；花后27 d共找到2 955個差異表達基因，其中，1 731、1 224個基因表達量分別呈上調和下調（圖1）。6類品種在花后7 d差異表達基因最多，其次是花后17 d，花后27 d最少，這可能是因為灌漿前期籽粒膨大生長階段差異基因較多。

圖1 不同類型小麥組間差異表達基因的維恩圖

2.3 差異表達基因的篩選及GO注釋和KEGG分析

發現花后7、17、27 d分別有1 743、1 195、981個DEGs在優質小麥（GN與GBN）中上調，在劣質小麥（BB、BN與BBN）中下調，對差異表達的基因進行GO功能分類分析發現，三個時期差異基因均主要分布在生物過程（biological process）的metabolic process和cellular process、細胞成分（cell component）的cell和cell part以及分子功能（molecular function）的binding和catalytic activity中。

利用KEGG分析研究了與品質相關的生物代謝通路。發現花后7 d篩選出的1 743個DEGs被富集到103條通路中，包括DNA及RNA的合成及轉運、碳循環、氮代謝、氨基酸代謝、淀粉及糖代謝等，富集DEGs數目最多的代謝通路有：protein processing in endoplasmic reticulum（36）、starch and sucrose metabolism（22）、spliceosome（20）、plant-pathogen interaction（18）、RNA transport（17）（圖2A）?；ê?7 d篩選出的1 195個DEGs被富集到98條通路中，包括DNA及RNA的合成及轉運、植物激素信號轉導、氨基酸的生物合成、碳循環等，富集DEGs數目最多的代謝通路有：RNA transport（15）、spliceosome（12）、biosynthesis of amino acids（12）、plant-pathogen interaction（12）（圖2B）?；ê?7 d篩選出的981個DEGs被富集到89條通路中，包括DNA及RNA的合成及轉運、氨基酸生物合成、內質網蛋白合成、淀粉及糖代謝等，富集DEGs數目最多的代謝通路有：RNA transport（14）、protein processing in endoplasmic reticulum（10）、spliceosome（9）、biosynthesis of amino acids（9）、starch and sucrose metabolism（9）（圖2C）。

2.4 蔗糖與淀粉代謝通路有關的差異基因分析

對蔗糖與淀粉代謝通路進行研究發現，在以GB為對照的條件下，花后7、17 d及27 d BB與GB、BBN與GB間淀粉合成通路中差異表達基因最多?；ê? d，相較于GB小麥，其他類型小麥下調差異基因較多，花后17 d與花后27 d，BB小麥與GN小麥均為上調基因較多，其他類型為下調基因較多（表3）。

圖2 花后7 d（A）、17 d（B）及27 d（C）差異表達基因KEGG富集分析

對淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達基因進行分析，以GB小麥為對照，從花后7 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、5、8、6和12個差異表達基因，從花后17 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、4、6、4和4個差異表達基因，從花后27 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到7、4、7、4和5個差異表達基因，主要涉及糖代謝過程中的蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuS，EC2.4.1.13）和轉化酶（invertase，INV，EC3.2.1.26）、蔗糖磷酸酯酶（sucrose phosphatase，SPP）、蔗糖磷酸合酶（sucrosephosphate synthase，SPS），淀粉代謝過程中的去分支酶（debranching enzyme，DBE）、α-淀粉酶（alpha-amylase，EC3.2.1.1）和 β-淀粉酶（beta-amylase，EC3.2.1.2）。

SPS基因花后7 d在BN小麥中上調，花后17 d在BB小麥中下調，花后27 d在GN、BN與BBN小麥中均上調。相反，SuS在花后7 d的BB、BN小麥中上調，在GN與BBN中下調，花后17 d的BB、GN、BN以及BBN小麥中均上調，花后27 d的BB小麥中上調；INV在花后7 d的BB、BN與GBN中均下調，花后17 d在BB、BN和GBN小麥中均下調，花后27 d在BB、GN、GBN、BBN小麥中均下調（表4—表6）。推測花后7 d GN小麥、GBN及BBN小麥蔗糖分解能力較弱；花后17 d GN小麥及BBN小麥蔗糖分解能力高于GB小麥；花后27 d GN、BN與BBN小麥的蔗糖合成能力高于GB小麥。

6-磷酸葡萄糖異構酶（glucose-6-phosphate isomerase，GPI，EC5.3.1.9）基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調。DBE基因在花后不同時期其他5類小麥中均上調，推測與成熟期GB小麥總淀粉含量最低一致。α-淀粉酶和β-淀粉酶基因在花后7 d的BB小麥中下調，但花后17 d BB小麥中的α-淀粉酶上調，可以進一步推測是成熟期支鏈淀粉含量低于GB小麥的原因之一。

表3 不同時期不同類型DEGs及與淀粉合成相關的DEGs匯總

表4 花后7 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關的DEGs

表5 花后17 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關的DEGs

表6 花后27 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關的DEGs

2.5 qRT-PCR驗證差異表達基因

為驗證轉錄組測序結果的真實性，從淀粉合成通路中隨機挑選了7個候選基因（Traes＿7BL＿11C5C7BC4、Traes＿7AS＿7D1CD8641、Traes＿3B＿55B913FD2、Traes＿6BL＿C22DEC10D、Traes＿2AL＿0C8275227、Traes＿6BL＿FC54B7E8F和Traes＿7DS＿E488AA1F2）進行qRT-PCR驗證（圖3、4、5）。將驗證結果與RNA-seq數據進行相關性分析，兩者的相關系數較高且表達趨勢基本相同，表明RNA-Seq的分析結果可靠。

圖5 qRT-PCR驗證花后27 d RNA-Seq結果

3 討論與結論

本研究采用RNA-Seq技術分析不同面包、面條品質類型小麥在花后7、17、27 d的差異表達基因。以相同時期面包優質小麥為對照，分別發現4 529、3 198、2 955個差異表達基因。通過對不同加工品質小麥差異表達基因的GO富集分析，發現不同類型小麥在淀粉代謝通路中的差異表達基因及其參與的生物過程以及本身的分子功能。與面包優質小麥進行比較，不同類型小麥在花后不同時期差異表達的基因主要參與代謝過程、細胞生理過程、細胞、細胞組分、結合功能以及催化活性。對不同類型小麥的KEGG通路注釋結果發現，不同類型小麥之間的差異表達基因在蛋白質合成的內質網加工過程通路、淀粉和蔗糖代謝通路、剪接體通路、RNA轉錄通路、氨基酸合成通路以及核糖體通路等通路富集較多。

淀粉與蔗糖代謝在植物發育、抗逆反應等多個生物學過程中發揮重要作用。小麥淀粉含量及特性對小麥品質特別是面條品質影響較大，培育面包面條兼優小麥的其中一個思路即為在面包優質小麥的基礎上提高面條品質。因此，我們重點對淀粉與蔗糖代謝通路進行分析。對淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達基因進行分析，以面包優質小麥為對照，從花后7、17、27 d的面包劣質、面條優質、面條劣質、包條兼優以及包條均劣品種分別篩選到一些差異表達基因，主要涉及糖代謝過程中的蔗糖合成酶（SuS）和轉化酶（INV）、蔗糖磷酸酯酶（SPP）、蔗糖磷酸合酶（SPS），淀粉代謝過程中的去分支酶（DBE）、α-淀粉酶和β-淀粉酶。在蔗糖代謝方面，蔗糖在蔗糖合酶和轉化酶調控下參與淀粉的合成［12］，蔗糖磷酸酯酶和蔗糖磷酸合酶在蔗糖合成中起關鍵作用［13，14］。INV對蔗糖的水解作用是單向的，而SuS能可逆地催化蔗糖代謝，通常認為SuS主要起水解蔗糖的作用。SPS在碳水化合作物代謝方面發揮重要作用，可以調控碳在淀粉合成和碳水化合物積累間的分配［15］。

催化6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖相互轉化的6-磷酸葡萄糖異構酶（GPI）［16］基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調，而6-磷酸葡萄糖是合成ADPG的重要物質基礎［17］，因此推測BB籽粒中ADPG的合成能力高于GB小麥，這與BB小麥具有最高的總淀粉及直鏈淀粉含量相符合。α-淀粉酶與β-淀粉酶是淀粉水解過程中的關鍵酶，其中α-淀粉酶可以水解淀粉內部的α-1，4-糖苷鍵，β-淀粉酶能將直鏈淀粉分解為麥芽糖；淀粉脫支酶（DBE）專一水解α-1，6-糖苷鍵，支鏈淀粉經淀粉酶水解產生的極限糊精，由脫支酶水解去除α-1，6-糖苷鍵，再在α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用下徹底水解［18］。

不同品質類型小麥籽粒中蔗糖代謝形成淀粉合成前體的相關酶類（SPS、INV、SuS）以及淀粉代謝相關酶類（DBE、α-淀粉酶與β-淀粉酶）存在差異，是總淀粉含量及其組分的差異原因之一。面包劣質小麥籽粒淀粉含量及直鏈淀粉含量均高于面包優質小麥，可能是由于其6-磷酸葡萄糖異構酶基因的高表達導致。其他5類小麥品種中DBE與α-淀粉酶基因均高于面包優質小麥，可能是面包優質小麥總淀粉含量較低、支鏈淀粉含量較高的原因。因此調控籽粒蔗糖代謝通路以及淀粉水解通路可以作為調控小麥加工品質的新思路。