近紅外測定丹參提取濃縮過程中的丹參酮類的含量

張偲偲，王德勤，朱晶晶，李楚源，王智民，匡艷輝*

(1.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣州510515；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京100700）

復方丹參片是一種常用的中成藥，用于防治心腦血管疾病[1]，能夠活血化瘀，理氣止痛，用于治療氣滯血淤所致的胸痹，冠心病，心絞痛等病癥[2]。丹參是復方丹參片中的成分之一，為君藥，需經過提取濃縮的工藝以中間體入藥。作為原料藥，丹參提取物的質量對產品的質量起著至關重要的作用。2015版《中國藥典》中對于復方丹參片的含量測定，使用高效液相色譜法檢測丹參酮類（檢測指標:丹酚酸B和丹參酮ⅡA），但采用此法有時間滯后性，難以快速、高效、實時地反映丹參提取濃縮過程中含量的變化情況，不便用于丹參提取濃縮過程中含量的實時監測和過程控制，從而無法保證相關過程的可控性。由查閱文獻以及從臨床應用的研究中可知，不同廠家之間甚至相同廠家不同批號之間的復方丹參片的質量和療效的差異很大[3]。因此可知，為了適應生產過程的實時監控，建立一種快速，高效的過程分析技術方法是目前大勢所趨。

作為一種間接分析技術，近紅外（NIR）光譜分析具有樣品處理過程無損簡單、分析過程快速高效、無試劑消耗等特點，已經陸續用于制藥過程藥效成分含量的在線檢測、監控、天然藥物鑒別、中藥材的產地鑒別等[4-8]。將NIR技術應用于藥材的質量檢測，中藥生產過程的監控[9-11]，可實現入庫、投料和生產過程中的現場快速檢測，從而保證最終產品的質量安全、穩定、均一、有效。

本研究基于NIR技術結合化學計量學方法對復方丹參片生產過程中丹參的提取和濃縮過程中的二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA進行定量分析，通過近紅外圖譜建立相關模型，實現生產過程實時質量控制，為中藥制藥生產過程監測方法開發提供參考思路。

1 儀器及試藥

德國BRUKER-MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀（光源:鹵鎢燈，檢測器:PbS，附漫反射積分球，樣品旋轉器和石英樣品杯）；ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色譜系統 （美國Waters公司、二極管陣列（PDA）檢測器、柱溫箱、Empower 3色譜工作站）；Milli-Q型超純水制備儀 （美國Millipore公司）；SB25-12DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；Satorius BT214D萬分之一分析天平。

乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。對照品二氫丹參酮（批號:A0060，購自成都曼思特生物科技有限公司）；隱丹參酮 （批號:110852-200305），丹參酮Ⅰ（批號:110867-200406），丹參酮ⅡA（批號:110766-200619），均購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定使用。

2 方法

2.1 丹參提取濃縮液制備

參考 《中國藥典》2015年版復方丹參片中丹參的提取、濃縮工藝條件:稱取2.00kg的丹參飲片，精密稱定，第一次提取時，加5倍量的95%乙醇加熱回流1.5h，提取液過濾后濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.20。第二次提取時，于藥渣加入4倍量的50%乙醇加熱回流1.5h，提取液過濾，濾液回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.20。第三次提取時往藥渣加入4倍量的水加熱回流2h，過濾，得到濾液。將三次所得的濃縮液混合并濃縮至相對密度為1.30～1.41。提取過程中，沸騰開始時取樣，之后每15min取一次樣，每次取樣量為5mL，濃縮過程中，每3min取樣，每次取樣2mL，將取得樣進行NIR掃描和UPLC含量的測定。

2.2 NIR光譜采集

NIR測定條件為室溫環境下測定，選定透射模式Near-IR Transmittance， 掃描范圍12500～4000cm-1，掃描次數:64次，樣品池2mm，分辨率:8cm-1，每個樣品掃描一次光譜。

2.3 UPLC方法測定二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

ACQUITYHSS-T3? HSST3 1.8μm 2.1×100mm色譜柱；以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相；理論板數以丹參酮ⅡA不低于30000。梯度洗脫（0～1min,3%～50%A；1～7min，50%～55%A；7～10min,55%～70%A；10～11min，70%～95%A）， 柱溫30℃； 進樣量2μL， 流速0.5ml·min-1。 檢測波長為275nm。

2.3.2 對照品溶液的配置

取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含145μg二氫丹參酮，142μg隱丹參酮，228μg丹參酮Ⅰ，403μg丹參酮ⅡA的混合溶液，即得。

2.3.3 樣品溶液的配置

將提取液樣品直接用0.25μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。將濃縮液稀釋5倍后用0.25μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。其中檢驗樣品集為[30min取的95%乙醇提取液 （樣品編號1），45min取的95%乙醇次提取液（樣品編號2），9min取的50%乙醇濃縮液（樣品編號3），12min取的50%乙醇濃縮液（樣品編號4），15min取的95%乙醇濃縮液（樣品編號5）]，預測樣品 集 為 編 號 為 樣 品6、8、13、33、42、50、56[樣 品6（60min取的95%乙醇的提取液），樣品8（105min取的95%乙醇提取液），樣品13（45min取的50%乙醇提取液），樣品15（90min取的50%乙醇提取液），樣品42（9min取的95%乙醇濃縮液），樣品44（15min取,95%乙醇濃縮液，稀釋5倍），樣品50（3min取的50%乙醇濃縮液），樣品56（18min取的50%乙醇提取液，稀釋5倍）]。

3 結果和討論

3.1 提取濃縮液中二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量測定結果

建立的二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的標準曲線中，線性回歸方程分別為二氫丹參酮Y=7012X-28077(R2=1，n=6)， 隱丹參酮Y=8000X-22714(R2=1,n=6)，丹參酮ⅠY=5018X-58986(R2=1,n=6)，丹參酮ⅡA Y=2268X+12045（R2=1,n=6）。 二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA分別在72.5～725ng、71～710ng、114～1140ng、203～2030ng范圍內線性關系良好；精密度實驗顯示二氫丹參酮的RSD為0.54%，隱丹參酮的RSD為0.39%，丹參酮Ⅰ的RSD為2.14%，丹參酮ⅡA的RSD為0.42%，結果顯示良好。穩定性試驗結果顯示在0、2、4、8、16、24h測定二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量的RSD值分別為4.33%，0.72%，4.67%和0.95%；加樣回收率試驗結果顯示二氫丹參酮的回收率是98.7%（RSD=1.55%），隱丹參酮的回收率97.5%（RSD=1.13%），丹參酮Ⅰ的回收率是90.8%（RSD=0.51%），丹參酮ⅡA的回收率是104.2%（RSD=0.92%）。

3.2 二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的定量分析模型的建立及評價

3.2.1 樣品集近紅外光譜測定

其掃描得到的光圖譜經過SG平滑處理得到以下光譜圖，詳見圖1。

圖1 為丹參樣品的近紅外圖譜Fig1.TheNear-infrared spectra of Salvia miltiorrhiza samples

3.2.2 數據預處理和數據模型構建

利用定量分析軟件建立校正模型，采用化學計量法將上述不同時間點收集的樣品經掃描所得的光譜圖和測得的UPLC含量值進行分析，選定光譜影響值和化學值誤差Residual剔除測定的異常值，軟件計算后得出的模型比較RMSECV和R2的大小，選擇光譜范圍和預處理方法建立4個較好的校正模型，采用外部驗證，并以NIR數學模型的主要參數即R2和RMSECV為指標確定最佳模型，結果見表1，表2，表3，表4。 （軟件為Bruker OPUS6.5/QUANT-2）

表1 不同預處理方法和譜區范圍對二氫丹參酮模型的影響Table 1 Effect of different pretreatment methods and spectral region on model ofdihydrotanshinone

表2 不同預處理方法和譜區范圍對隱丹參酮模型的影響Table2 Effects of different pretreatment methods and spectral regions on model ofcryptotanshinone

表3 不同預處理方法和譜區范圍對丹參酮Ⅰ模型的影響Table 3 Effects of different pretreatment methods and spectral regions on model oftanshinoneⅠ

表4 不同預處理方法和譜區范圍對丹參酮ⅡA模型的影響Table 4 Effects of different pretreatment methods and spectral regions on model oftanshinoneⅡA

由以上四個模型可看出，不同的預處理方法，在各波段下的光譜范圍不同，線性關系都較良。

3.2.3 校正模型的驗證和最優模型的選擇

將檢驗樣品集的二氫丹參酮等四個丹參酮類成分的UPLC測出的含量以及近紅外光譜圖關聯到上述四個模型中，可計算出真實值和預測值之間的相關系數以及偏差，以下表5是各成分校正模型對檢驗樣本集的預測結果相關系數和預測值與真實值之間的偏差的比較。

通過軟件對四種校正模型中各成分的含量真實值及預測值之間進行比較計算，選擇RMSEP和偏差（BIS）最小的模型即為最優模型。相關系數可見圖2，圖3，圖4和圖5。模型Ⅲ為二氫丹參酮的最佳校正模型；模型Ⅰ為隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的最佳校正模型。

表5 四個校正模型對檢驗樣本集的各成分預測結果的相關系數Table 5 The correlation coefficients of four calibration models for the test sample sets

圖2 二氫丹參酮的近紅外測定值和色譜法測定值的相關系數圖譜Fig 2 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of dihydrotanshinone

圖3 隱丹參酮的近紅外測定值和色譜法測定值的相關系數圖譜Fig 3 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of cryptotanshinone

3.2.4 模型穩定性與預測效果評價

3.2.4.1 精密度試驗

取45min取的95乙醇提取的提取液1份，對該份樣品重復掃描6次，掃描所得光譜和二氫丹參酮等四個丹參酮類成分的含量校正模型進行關聯，測得二氫丹參酮，隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量RSD分別為1.73%，3.01%，2.78%，2.51%。由結果可知該校正模型精密度良好。

3.2.4.2 重現性試驗

圖4 丹參酮Ⅰ的近紅外測定值和色譜法測定值的相關系數圖譜Fig 4 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of tanshinon

圖5 丹參酮ⅡA的近紅外測定值和色譜法測定值的相關系數圖譜Fig 5 Correlation coefficient image of Near infrared values and UPLC values of tanshinoneⅡA

取45min取的95乙醇提取的提取液樣品6份，分別掃描，掃描所得光譜和二氫丹參酮等四個成分的含量校正模型進行關聯，進行計算。隱丹參酮，丹參酮Ⅰ，丹參酮ⅡA的含量RSD分別為1.19%，2.73%，1.64%，1.35%。由結果可知該校正模型的重現性良好。

3.2.4.3 模型預測效果的評價

為了檢測模型是否有效，將模型計算出的二氫丹參酮等四個丹參酮類成分的NIR預測值與UPLC的實測值進行對比，結果見表6。由表6結果可知，真實值和模型校正預測值的平均偏差均小于5%，說明預測結果較為準確。本次研究所建立的復方丹參片中二氫丹參酮等四個丹參酮類成分的含量值相關性模型預測性能良好。

表6 丹參酮類成分的NIR預測值與UPLC的實測值對比/mg·g-1Table 6 Thepredictability of Tanshinones by NIR compared with that by UPLC/mg·g-1

4 結論

該研究將NIR分析技術應用于丹參的提取濃縮過程中的二氫丹參酮等四個丹參酮類成分的含量進行分析。建立二氫丹參酮等四個丹參酮類成分的NIR模型，可用于監測丹參提取濃縮過程中上述成分的質量變化過程，可用于指導丹參提取濃縮過程的終點，最終實現復方丹參片生產過程中的全程實時質量監控及終點判斷，可嘗試用于工廠大生產時的含量實時在線監測。當需要檢測樣品的時間或空間條件與建模時不同，必須用檢驗集樣品檢驗該模型。如果最終模型的預測效果降低，真實值和模型校正預測值的平均偏差過大，就需要在校正集樣品增加這一檢驗樣品，并再次按原步驟修改校正集樣品，穩定準確的模型需要在使用的過程中不斷的維護與完善。