胱天蛋白酶募集域蛋白9基因多態性與急性胰腺炎易感性的相關性研究

王靜 任大賓 楊志文

1上海市松江區中心醫院消化內科，上海 201600；2上海市松江區中心醫院藥劑科，上海 201600

研究表明，基因多態性可能是AP患者重要的影響因素之一，可以增加AP的發病風險。其中Toll樣受體、腫瘤壞死因子α、IL-8、IL-1β、IL-6等炎癥因子基因多態性是AP 嚴重程度和炎癥進展中重要的易感因素[1-5]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9，Card 9)是一種表達于髓系細胞的接頭蛋白，通常與Bcl 10蛋白相互作用，形成Card 9/Bcl 10復合體，然后激活NF-κB、MAPK炎癥信號通路，釋放大量炎癥因子[6]。本課題組前期研究發現，AP患者外周血Card 9表達水平可作為評估患者病情嚴重程度的一個有效的臨床監測指標[7]，沉默AP大鼠Card 9表達可抑制NF-κB、p38炎癥信號通路，減輕胰腺的炎癥損傷[8]。因此，本研究探討Card 9基因多態性與AP患病風險的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年6月至2020年2月間上海市松江區中心醫院收治的70例AP 患者的臨床資料。AP診斷均符合中華醫學會消化病學分會胰腺疾病學組制定的標準[9]，其中MAP 34例，MSAP 27例，SAP 9例。以松江區中心醫院體檢健康者70例為對照組。所有受試者均排除慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等干擾指標，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1．Card 9基因多態性檢測：抽取研究對象外周血1 ml于EDTA抗凝管，提取全血DNA。采用TaqMan探針法[10]檢測Card 9基因rs10870077、rs4077515、rs10781499、rs141992399、rs139265120多態性位點。引物及探針序列見表1，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應條件為95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、60℃ 30 s，40個循環。每次循環后掃描熒光信號，利用Bio-Rad CFX96熒光定量儀讀取信號，并利用機器自帶軟件進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型。

表1 Card 9基因多態性檢測引物序列

2．血清Card 9 mRNA表達檢測：抽取研究對象外周血，Ficoll密度梯度法分離外周血單核細胞，提取RNA。采用實時熒光定量PCR檢測Card 9 mRNA表達，以GAPDH為內參。Card 9正向引物序列為5′-CCCTCACGCATCACACCTTACC-3′，反向引物序列為5′-GTCCAGGAGCACACCCACTTTC-3′；內參GAPDH正向引物序列為5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′，反向引物序列為5′-AGGCTGTTGTCATACTTC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應條件為95℃10 min，95℃15 s、60℃ 45 s，40個循環。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

3．血清IL-6和降鈣素原水平檢測：抽取研究對象外周血，4 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，分離血清。采用電化學發光法檢測血清IL-6、降鈣素原水平。

4．血清CRP水平檢測：抽取研究對象外周血，4 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，分離血清。采用散色比濁法檢測CRP水平。

三、統計學處理

結 果

一、臨床資料

27例MSAP患者中膽源性19例、高脂血癥5例、特發性3例，無器官功能衰竭和死亡。9例SAP患者中膽源性4例、高脂血癥3例、酒精性1例、特發性1例，2例發生器官功能衰竭，1例死亡。MSAP組、SAP組患者的白細胞計數及血淀粉酶、谷丙轉氨酶、乳酸脫氫酶、CRP水平均顯著高于MAP組和對照組(表2)。

表2 70例急性胰腺炎患者的臨床資料

二、Card 9基因多態性性位點與AP患病風險的相關性

AP患者Card 9 rs10870077 C﹥G突變率(CG基因型占比)顯著高于對照組(50.0%比31.4%)，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Card 9 rs10870077 CG基因型是AP的易感因素(表3)。AP患者Card 9 rs4077515AG、rs10781499AG基因型占比與對照組差異無統計學意義(表4)，而rs141992399 C﹥G、rs139265120 A﹥G突變率太低，無法進行統計學分析(表5)，表明這4個Card 9基因位點突變不是AP的易感因素。

表3 急性胰腺炎組與對照組Card 9 rs10870077位點基因類型和等位基因的分布[例(%)]

表4 急性胰腺炎組與對照組Card 9 rs4077515、rs10781499位點基因型和等位基因的分布[例(%)]

表5 急性胰腺炎組與對照組Card 9 rs141992399、rs139265120位點基因型和等位基因的分布[例(%)]

三、Card 9 rs10870077 CG基因型與AP病情嚴重程度的相關性

MAP組、MSAP組、SAP組患者Card 9 rs10870077 CG基因型與對照組的差異均無統計學意義(P值均>0.05)，提示Card 9 rs10870077 CG基因型與AP病情嚴重程度無相關性(表6)。

表6 3組急性胰腺炎患者及對照組Card 9基因rs10870077 C﹥G突變的分布[例(%)]

四、Card 9 rs10870077 CG基因型對AP患者血清Card 9 mRNA表達的影響

Card 9 rs10870077 CG、rs4077515AG、rs10781499AG基因型AP患者和對照組血清Card 9 mRNA表達量分別為6.20±2.82、5.00±2.22、5.01±2.24、3.90±1.96，rs10870077 CG基因型AP患者明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而rs4077515AG、rs10781499AG基因型AP患者血清與對照組差異無統計學意義，提示Card 9 rs10870077 C﹥G突變可上調AP患者血清Card 9 mRNA表達。

五、Card 9 rs10870077 CG基因型對AP患者血清IL-6水平的影響

Card 9 rs10870077 CC、GG、CG基因型AP患者的血清IL-6水平分別為(372.5±1127.9)、(385.5±598.7)、(614.7±1531.8)ng/L，CG基因型較CC、GG基因型顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而CC基因型與GG基因型IL-6水平差異無統計學意義。提示Card 9 rs10870077 C﹥G突變促進IL-6的合成及分泌，加重AP炎癥反應。

六、Card 9 rs10870077 CG基因型對AP患者血清CRP、降鈣素原水平的的影響

Card 9 rs10870077 CC、GG、CG基因型AP患者的血清CRP水平分別為(46.10±52.55)、(55.30±87.02)、(34.84±50.64 )mg/L，降鈣素原水平分別為(2.86±10.20)、(0.77±1.12)、(1.98±4.70)μg/L，CG基因型CRP水平顯著低于GG基因型，降鈣素原水平顯著高于GG基因型，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而CG基因型與CC基因型CRP、降鈣素原水平差異無統計學意義。提示Card 9 rs10870077 C﹥G突變與AP患者的細菌感染無相關性。

討 論

Card 9是髓系細胞的一種重要免疫炎性蛋白，參與NF-κB、MAPK信號通路的活化，釋放大量的炎癥因子。文獻報道，Card 9 rs372539632、rs1433023025、rs775284320、rs1278536786、rs372360475、rs137986801、rs1379376784、rs151075995、rs1342330215、rs773595074等23個位點基因突變與人類某些疾病相關，如真菌感染、IgA腎病、肺結核、原發性免疫性血小板減少、類風濕性關節炎、強直性脊柱炎[11]。目前較多的研究聚焦于Card 9基因多態性與炎性腸病的關系[12-15]，例如Card 9基因N端3個單核苷酸的多態性位點(rs10870077、rs4077515、rs10781499)能夠與含有Card結構域的Bc110蛋白結合，促進Card 9/Bc110復合物形成，上調炎癥因子分泌，加重炎性腸病[12-14]；Card 9基因C端2個單核苷酸的多態性位點(rs141992399、rs139265120)抑制泛素蛋白鏈接酶(TRIM62)招募，阻斷Card 9/Bc110復合物的形成，下調炎癥因子釋放，減輕炎性腸病[15]。

本課題組前期研究發現，Card 9與AP患者的臨床轉歸密切相關[7-8]。胰腺炎患者外周血單核細胞Card 9表達升高，對胰腺炎診斷有較高的靈敏度和特異度，可作為評估AP患者病情嚴重程度的臨床指標[7]。應用siRNA沉默Card 9基因可下調Card 9表達，從而抑制TRL4介導NF-κB、p38炎癥信號通路的活化，減輕SAP胰腺的炎癥損傷[8]。但Card 9在AP中的作用機制尚待進一步研究。

本研究采用TaqMan探針法檢測Card 9基因rs10870077、rs4077515、rs10781499、rs141992399、rs139265120多態性位點。結果顯示，Card 9基因rs10870077位點C﹥G突變是AP發生的易感因素，但與AP病情嚴重程度無相關性，這可能歸因于Card 9 rs10870077 C﹥G突變的SAP患者僅3例，尚需多中心、大規模前瞻性臨床試驗進一步證實。本研究結果還顯示，Card 9 rs10870077 C﹥G突變上調AP患者Card9mRNA表達水平，誘導IL-6炎癥因子釋放，促進AP炎癥聯級反應，但對感染指標CRP、降鈣素原沒有影響，這可能歸因于Card 9主要分布在單核巨噬細胞，而單核巨噬細胞活化是AP發展早期的啟動因子[16]，且AP早期為無菌性炎癥。綜上所述，Card 9基因rs10870077 C﹥G突變可能是AP發生的易感因素，但與細菌感染無明確的相關性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突