長鏈非編碼RNA FBXL19-AS1靶向miR-339-3p對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

董娜娜 郭瑞娟 付愛芹

1煙臺市煙臺山醫院腫瘤內一科，煙臺 264000；2煙臺市煙臺山醫院東院腫瘤內科，煙臺264000

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和微小RNA(microRNA, miR)是兩類小分子非編碼RNA，兩者通過相互作用參與腫瘤的發生和發展，可作為腫瘤靶向治療的分子靶點[1-3]。F-box和富含亮氨酸的重復蛋白19反義RNA 1(FBXL19-AS1)屬于lncRNA，lncRNA FBXL19-AS1在胃癌[4]、非小細胞肺癌[5]和乳腺癌[6]等腫瘤中表達升高，促進腫瘤發展進程。但lncRNA FBXL19-AS1對胰腺癌發生發展的影響未見報道。Starbase生物信息學軟件預測顯示，lncRNA FBXL19-AS1可能靶向結合miR-339-3p。研究表明，miR-339-3p在胃癌細胞中呈低表達，上調其表達可抑制胃癌細胞增殖并促進細胞凋亡[7]；miR-339-3p在結直腸癌組織和細胞系中表達下調，過表達miR-339-3p可抑制結直腸癌腫瘤生長和轉移[8]。但miR-339-3p對胰腺癌發生發展的影響也未見報道。本研究檢測lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p在胰腺癌組織和細胞中的表達水平，觀察其對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力及相關蛋白表達的影響，驗證lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的靶向關系，以期闡明lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p在胰腺癌發生發展中的作用，為胰腺癌治療提供新的分子靶點。

資料與方法

一、胰腺癌組織、細胞株lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p表達檢測

收集2017年1月至2019至8月間煙臺市煙臺山醫院手術切除且病理確診的73例胰腺癌患者的癌組織及匹配的癌旁正常胰腺組織(距離手術切緣>3 cm)。TNM分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期34例、Ⅳ期11例；低分化35例、中分化28例、高分化13例?；颊咝g前均未接受放療或化療等輔助治療。所有標本取下后立即置-196℃液氮中保存。

應用Trizol法抽提胰腺癌和癌旁組織總RNA，應用 RNA逆轉錄與擴增試劑盒(大連寶生物工程有限公司)逆轉錄成cDNA，按說明書操作。轉錄的cDNA行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應。lncRNA FBXL19-AS1正向引物序列為5′-GGT-ACAACTACGGATATGA-3′，反向引物序列為5′-TACGTCTCGACCATTACGCA-3′；miR-339-3p正向引物序列為5′-CGACATACGACTACGAGATA-3′，反向引物序列為5′-CGATTTACGATACGCAAGACGA-3′；內參GAPDH正向引物序列為5′-CGACTC-AGCGACGAGTCGA-3′，反向引物序列為5′-CTA-CGATACGGGAACAACGTCCG-3′；內參U6正向引物序列為5′-CGCTACGACTCGCGCTCTTC-3′，反向引物序列為5′-CTCGCGGCCAAGAGCTAGCG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴增產物的Ct值，采用公示2-△△Ct計算lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p相對表達量。每個樣品設3個復管，取均值。

正常胰腺上皮細胞株hTERT-HPNE及胰腺癌細胞株Capan-1、SW1990和PaTu8988均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。常規復蘇、傳代。取對數生長期細胞，采用上述相同方法檢測lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的表達量。

二、胰腺癌Capan-1細胞分組及檢測

1．Capan-1細胞分組：將Capan-1細胞分為NC組 (正常對照組)、si-NC組(轉染無意義陰性序列)、si-FBXL19-AS1組(轉染FBXL19-AS1小干擾RNA)，miR-NC組(轉染空質粒對照)、miR-339-3p組(轉染miR-339-3p過表達慢病毒載體)，si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p NC組(共轉染FBXL19-AS1 siRNA和miR-339-3p抑制劑陰性對照序列)、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組(共轉染FBXL19-AS1siRNA和miR-339-3p抑制劑)。所有siRNA、anti-miR構建及慢病毒包裝均由上海生工生物工程有限公司完成。以病毒∶細胞為100∶1的比例感染細胞24 h，更新培養液，以含1 g/ml嘌呤霉素的DMEM培養液處理24 h以殺死未被感染的細胞，取存活并感染的細胞進行培養及傳代。

2．Capan-1細胞增殖活性檢測：取NC組、si-NC組、si-FBXL19-AS1組、miR-NC組、miR-339-3p組、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p NC組、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組Capan-1細胞，以2.5×104個/孔接種于96孔板，分別培養0、12、48、72 h，到時間點加入10 μl CCK-8(日本株式會社)繼續孵育2 h，上酶標儀測每孔在波長450 nm處的吸光值(A450值)。

3．Capan-1細胞遷移和侵襲能力檢測：取上述各組對數生長期Capan-1細胞，調整為細胞密度5.0×104個/ml的細胞懸液。將Transwell小室(美國Corning公司)或預先在隔膜上室面鋪設Matrigel基質膠并自然晾干后的Transwell小室置于24孔板。上室加100 μl細胞懸液，下室加500 μl培養液，培養24 h后棄培養液，輕輕擦去隔膜上室面未穿膜細胞，經4%多聚甲醛固定、結晶紫染色，置顯微鏡下以200倍隨機取5個視野，計算穿膜細胞數，取均值。

4．Capan-1細胞cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達檢測：取上述各組對數生長期Capan-1細胞，以5.0×105個/孔接種于6孔板，培養24 h后用RIPA試劑提取細胞總蛋白。經BCA法定量蛋白后常規行蛋白質免疫印跡法檢測cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達，以β-actin為內參。一抗cyclinD1工作濃度1∶500，MMP2、MMP9和β-actin工作濃度均1∶1 000，辣根過氧化酶標記的二抗工作濃度1∶5 000。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件分析，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的靶向關系驗證

從Starbase數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn)搜索lncRNA FBXL19-AS1d的潛在靶向基因，通過雙熒光素酶報告基因法驗證lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的靶向關系。取對數生長期Capan-1細胞，以1.0×105個/孔接種于6孔板，采用LipofectamineTM2000脂質體法，將野生型(wild type，WT)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics或miR-NC，突變型(mutant type，MT)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics或miR-NC共轉染至Capan-1細胞，轉染時間為6 h，更換培養液，繼續培養24 h，收集細胞并裂解，應用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，按試劑盒說明書操作。實驗重復3次，取均值。

四、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織和各細胞株lncRNA FBXL19-AS1 和miR-339-3p表達量

胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA FBXL19-AS1表達量分別為2.96±0.21和1.00±0.13，癌組織顯著高于癌旁正常胰腺組織，差異有統計學意義(t=67.804，P<0.05)。胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織miR-339-3p表達量分別為0.37±0.05和1.00±0.11，癌組織顯著低于癌旁正常胰腺組織，差異有統計學意義(t=44.548，P<0.05)。

Capan-1、SW1990及PaTu8988細胞lncRNA FBXL19-AS1表達量分別為2.43±0.18、1.97±0.13和1.73±0.14，均顯著高于hTERT-HPNE細胞的1.00±0.07，miR-339-3p表達量分別為0.42±0.03、0.54±0.03和0.57±0.04，均顯著低于hTERT-HPNE細胞的1.00±0.05(F值分別為173.898、391.881，P值均<0.05)。其中以Capan-1細胞的lncRNA FBXL 19-AS1表達量最高， miR-339-3p表達量最低，故選擇Capan-1細胞株進行后續實驗。

二、敲減Capan-1細胞lncRNA FBXL19-AS1表達可抑制細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達

si-FBXL19-AS1組lncRNA FBXL19-AS1表達水平顯著低于si-NC組(0.42±0.02比1.04±0.08，t=22.556，P=0.000)，表明抑制lncRNA FBXL19-AS1表達的Capan-1細胞構建成功。

與NC組或si-NC組比較，si-FBXL19-AS1組細胞A450值、遷移細胞數、穿膜細胞數顯著下降，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而NC組與si-NC組各檢測指標差異均無統計學意義(表1、圖1)。提示抑制lncRNA FBXL19-AS1表達可以抑制Capan-1細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達。

表1 正常對照組、si-NC組、si-FBXL19-AS1組Capan-1細胞增殖、遷移、侵襲和相關蛋白表達的比較

圖1 正常對照組(1)、si-NC組(2)、si-FBXL19-AS1組(3)Capan-1細胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達

三、miR-339-3p過表達抑制Capan-1細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白的表達

miR-339-3p組miR-339-3p表達水平顯著高于miR-NC組(1.73±0.14比1.00±0.07，t=13.991，P=0.000)，表明miR-339-3p過表達的Capan-1細胞株構建成功。與miR-NC組比較，miR-339-3p組Capan-1細胞A450值、遷移細胞數、穿膜細胞數顯著下降，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖2、表2)。

圖2 miR-NC組、miR-339-3p組Capan-1細胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達

表2 miR-NC組與miR-339-3p組Capan-1細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的比較

四、抑制miR-339-3p可逆轉敲減lncRNA FBXL19-AS1對Capan-1細胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組miR-339-3p表達水平顯著低于si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC組(0.47±0.03比1.00±0.07)，表明抑制miR-339-3p 表達的si-FBXL19-AS1細胞株構建成功。

與si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC組比較，si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組細胞A450值、遷移細胞數、穿膜細胞數顯著上升，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達量顯著升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表3、圖3)。提示抑制miR-339-3p可逆轉敲減lncRNA FBXL19-AS1對Capan-1細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

表3 si-lncRNA FBXL19-AS1+anti-miR-NC組與si-lncRNA FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組Capan-1細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的比較

圖3 si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC組(1)、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p組(2)Capan-1細胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達

五、lncRNA FBXL19-AS1靶向調控miR-339-3p

通過Starbase生物信息學軟件檢索到lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的核苷酸序列存在連續結合位點(圖4)。經雙熒光素酶報告基因實驗驗證結果顯示，共轉染WT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics組Capan-1細胞的熒光素酶活性顯著低于共轉染WT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-NC組(0.47±0.04比1.00±0.10)，差異有統計學意義(t=14.763，P<0.05)，而共轉染MT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics組與共轉染MT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-NC組Capan-1細胞的熒光素酶活性分別為1.03±0.11和1.01±0.09，兩組差異無統計學意義(t=0.422，P=0.679)。提示野生組存在lncRNA FBXL19-AS1靶向調控miR-339-3p，而突變組沉默了lncRNA FBXL19-AS1表達，故不存在lncRNA FBXL19-AS1靶向調控miR-339-3p。

圖4 lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的結合位點

討 論

LncRNA是真核生物中廣泛存在的參與調控細胞增殖、分化和凋亡的小分子非編碼RNA，在腫瘤的發生、發展中起重要作用。研究表明，CASC19[ 9]、LINP1[10]和NT5E[11]等多種lncRNA在胰腺癌中高表達，促進胰腺癌的發展進程；而STXBP5-AS1[12]和MTSS1- AS[13]等lncRNA在胰腺癌中低表達，在胰腺癌的發展過程中起抑癌基因作用。lncRNA FBXL19-AS1是近年來新發現的一種lncRNA，參與多種腫瘤的發展進程。研究顯示，lncRNA FBXL19-AS1在乳腺癌細胞呈高表達，沉默其表達可削弱乳腺癌細胞增殖能力并加劇細胞凋亡，其作用機制與靶向調控miR-876-5p/FOXM1有關[14]；肺腺癌組織中lncRNA FBXL19-AS1高表達，且與肺腺癌患者不良預后密切相關，敲減其表達可靶向上調miR-203-3p表達，阻滯肺腺癌細胞的周期進程，并抑制肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，可作為肺腺癌預后的生物標志物及治療靶標[15]；lncRNA FBXL19-AS1在結直腸癌高表達，敲減其表達可靶向結合并上調miR-203表達，減弱體外結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制體內腫瘤生長和轉移[16]。但目前未見lncRNA FBXL19-AS1影響胰腺癌發生發展的相關報道。

本研究結果顯示，胰腺癌組織及Capan-1細胞lncRNA FBXL19-AS1表達升高，提示其可能促進胰腺癌的發展進程；敲減lncRNA FBXL19-AS1可顯著降低胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示敲減lncRNA FBXL19-AS1可抑制胰腺癌細胞的惡性表型，延緩胰腺癌發展進程，可作為胰腺癌治療的潛在的分子靶點。腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲受多種基因分子的調控，其中cyclinD1是細胞周期調控分子，可促進細胞周期由G1期向S期轉變，加快細胞周期進程，促進細胞增殖[17]；MMP2和MMP9是基質金屬蛋白酶家族成員，參與降解細胞外基質，促進腫瘤細胞遷移和侵襲[18]。本研究結果顯示，敲減lncRNA FBXL19-AS1可抑制胰腺癌細胞cyclinD1、MMP2和MMP9的蛋白表達，提示其可能通過調控cyclinD1、MMP2和MMP9的表達來影響胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

研究報道，miR-339-3p在膠質母細胞瘤組織和細胞中表達下調，其可靶向抑制IP6K2的表達，降低膠質母細胞瘤細胞增殖，并促進細胞凋亡[19]；miR-339-3p在黑色素瘤細胞系中表達降低，過表達miR-339-3p可靶向抑制MCL1，減弱黑色素瘤細胞的侵襲性，可作為抑制黑色素瘤細胞侵襲的分子靶點[20]。本研究結果顯示，胰腺癌組織及細胞系中miR-339-3p的表達明顯降低，過表達miR-339-3p對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲起抑制作用，提示miR-339-3p低表達是胰腺癌發生發展的促進因素，抑制miR-339-3p可逆轉敲減lncRNA FBXL19-AS1對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示lncRNA FBXL19-AS1可能通過靶向負調控miR- 339- 3p來促進胰腺癌細胞的惡性表型，進而促進胰腺癌發展進程。通過Starbase生物信息學軟件和雙熒光素酶分析證實lncRNA FBXL19-AS1與miR-339-3p的核苷酸序列存在連續結合位點，lncRNA FBXL19-AS1靶向調控miR-339-3p，lncRNA FBXL19-AS1/miR-339-3p軸可能為胰腺癌的靶向治療提供新的分子靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突