病死藍孔雀胚中細菌的分離與鑒定

焦鳳超 李迎曉 李洵 徐光科 趙瑜 饒丹 劉錦妮 吳海港 黃立 趙聘

摘? 要：2019～2020年，河南省某藍孔雀繁育基地連續出現死胚增多、出雛率下降等情況，通過對送檢藍孔雀死胚進行細菌病原學檢測，結果共檢出綠膿桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌四種細菌，分離率分別為38.82%、17.65%、17.65%和16.47%。其中綠膿桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為16.47%、綠膿桿菌和奇異變形桿菌混合感染分離率為10.59%、奇異變形桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為5.88%。由此可見，四種細菌單獨或混合感染可能是引起該孵化場死胚增多、出雛率下降的主要原因。

關鍵詞：藍孔雀;綠膿桿菌;大腸桿菌;陰溝腸桿菌;奇異變形桿菌;分離;鑒定

中圖分類號：S858.39? ? 文獻標識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2021）4-0033-05

奇異變性桿菌屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種條件性致病菌，自1981年首次被發現以來，該菌對多種動物致病的報道不斷出現[1-7]。陰溝腸桿菌屬于腸桿菌科腸桿菌屬，近年來關于動物發病的報道屢見不鮮[8， 9]。綠膿桿菌，又稱為銅綠假單胞菌，該菌在自然界廣泛分布，對雞胚、鴨胚、鵝胚、鴿胚等表現出較強的致病性[10-13]。禽大腸桿菌是引起雞、火雞及其它禽類局部或全身性大腸桿菌病的病原，常表現為心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎、輸卵管炎等癥狀，是目前嚴重危害養禽業的傳染病之一[14]。

河南省某藍孔雀繁育基地近兩年來連續出現死胚增多、出雛率下降等情況，筆者對死亡孔雀胚蛋進行細菌分離培養、16S rDNA基因檢測和系統發育分析，為揭示孔雀胚死亡原因和孔雀細菌性疾病的預防提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 病料? 樣品來源于河南省某藍孔雀繁育基地的死亡藍孔雀胚蛋85枚。

1.2? 主要試劑和實驗動物? 營養肉湯、營養瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、細菌微量生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司;無菌脫纖維羊血購自南京茂捷生物科技有限公司;即用型Taq酶PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司;3日齡藍孔雀購自信陽市鳳天農業科技有限公司。

1.4? 細菌學檢查

1.4.1? 細菌的分離培養? 仔細檢查死亡胚蛋外殼完整程度，丟棄蛋殼破損的胚蛋。將死亡胚蛋外殼消毒后，無菌采集胚體內臟組織，劃線接種于鮮血瓊脂培養基，37 ℃培養24 h，挑取單菌落分別接種鮮血瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基和營養肉湯，觀察細菌的生長表現，并挑取單菌落革蘭氏染色后鏡檢。

1.4.2? 生化試驗? 將分離菌純培養物接種細菌微量生化鑒定管，37 ℃培養24～48 h后記錄結果。

1.4.3? 分子生物學檢測

1.4.3.1? 引物設計? 參考文獻合成大腸桿菌phoA基因、綠膿桿菌toxR基因、奇異變形桿菌ureR基因、沙門菌invA基因和細菌通用16S rRNA引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 具體信息見表1。

1.4.3.2? 16S rDNA序列測定與分析? PCR反應體系25 μL：2× Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，超純水9.5 μL。擴增條件：95 ℃ 預變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環;72 ℃延伸 5 min。

PCR產物經電泳分析后，送生工生物工程 （上海） 股份有限公司測序，并通過在線Blast檢索確認。

1.4.3.3? 細菌特異性基因PCR檢測? 對經過16S rDNA檢測和序列初步分析的細菌，應用合成的細菌特異性基因引物進行PCR檢測。PCR產物經電泳分析后，送生工生物工程 （上海） 股份有限公司測序，并通過在線Blast檢索確認。

1.5? 動物致病性試驗? 將3日齡的藍孔雀分為若干組，試驗組腹腔注射0.1 mL（約2×109CFU）經 37 ℃ 200 r/m振搖培養16 h的主要種類分離菌的液體培養物;同時設立對照組，腹腔注射0.1 mL滅菌液體培養基。接種后每天觀察并記錄各組發病死亡情況。無菌采集死亡孔雀和人為處死孔雀的內臟組織進行細菌分離鑒定[19-22]。

2? 結果

2.1? 細菌分離與染色? 從死亡的孔雀胚蛋中主要分離到4種類型的細菌。

菌1：在麥康凱瓊脂培養基上形成圓形凸起、光滑濕潤并且邊緣整齊的紅色菌落，在營養瓊脂上長成隆起、濕潤、光滑、灰白色菌落。革蘭氏染色陰性的直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對存在。

菌2：在麥康凱培養基上長出圓形、扁平、半透明、無色、濕潤菌落;在SS培養基上長出橘黃色或中心成黑色的菌落。革蘭氏染色鏡檢發現該分離菌為革蘭氏陰性的中等大小、兩端鈍圓的桿菌。

菌3：分離菌在SS培養基上長出無色的菌落。革蘭氏染色鏡檢發現該分離菌為革蘭氏陰性的中等大小、兩端鈍圓的桿菌。

菌4：在營養瓊脂培養基上形成潤滑、隆起、邊沿整齊菌落，且培養基逐漸變為綠色。革蘭氏染色鏡檢該菌為革蘭氏陰性菌中等大小，單個或成對，呈短鏈或桿狀。

2.2? 生化試驗結果? 四種分離菌生物特性見表2。

2.3? 分子生物學檢測結果? 根據菌3的16S rDNA PCR檢測以及基因序列在線Blast檢索，確定菌3為陰溝腸桿菌（圖1）;根據菌1、菌2和菌4的16S rDNA序列在線Blast檢索和特異性基因PCR檢測（圖2～圖4），確定菌1為大腸桿菌、菌2為奇異變形桿菌、菌4為綠膿桿菌。

2.4? 孔雀胚蛋帶菌情況統計結果? 根據生化試驗和分子生物學檢測結果，從85枚孔雀死胚蛋中共分離到四種主要細菌：綠膿桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌，分離率分別為38.82%、17.65%、17.65%和16.47%，并且存在一定的混合感染情況，詳情見表3。

2.5? 動物致病性試驗結果? 菌1試驗組的孔雀在接種之后普遍出現精神沉郁，24 h內死亡3只，剖檢變化可見心包積液，肝臟、脾臟充血現象;病程較長的可見不同程度的肝周炎、心包炎和氣囊炎現象。

菌2試驗組的孔雀從接種10 h后出現精神沉郁、厭食，約24 h后出現腹瀉和死亡，至試驗的第4天，5只孔雀全部死亡，對照組孔雀無異常。

菌3試驗組的孔雀從接種24 h后出現精神沉郁、厭食，腹瀉等臨床癥狀。

菌4試驗組的孔雀接種18 h后出現精神沉郁、厭食、腹瀉等臨床癥狀，48 h后死亡2只;對照組孔雀均無異常。

無菌采集試驗組發病孔雀肝臟和脾臟病料，抹片經革蘭染色鏡檢細菌及細菌分離，各試驗組均能發現和分離到原接種菌。

3? 討論

針對某藍孔雀繁育基地近兩年來連續出現死胚增多、出雛率下降等情況，本研究對信陽市某藍孔雀繁育基地送檢的85枚病死胚蛋進行培養、生化特性及分子生物學鑒定，確定分離的細菌分別為綠膿桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌和奇異變形桿菌，且分離率分別為38.82%、17.65%、17.65%和16.47%。其中，綠膿桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為16.47%，綠膿桿菌和奇異變形桿菌混合感染分離率為10.59%，奇異變形桿菌和大腸桿菌混合感染分離率為5.88%。由此可見，四種細菌單獨或混合感染可能是引起孵化場死胚增多、出雛率下降的主要原因。這與課題組成員前期的部分研究結果相一致[19， 20]。

目前國內對藍孔雀孵化期致病因素的研究資料較少，而關于家禽胚蛋細菌性病原的分離鑒定報道比較常見[11， 21-23]。郭繁霞等[11]將遼寧省某種雞孵化場送檢的245枚病死雞胚進行病原分離鑒定，最終確定禽波氏桿菌和奇異變形桿菌的混合感染是引起該場疫情發生的主要原因。宮艷杉[22]對山東省某多個種鴨場12個批次共計315枚20日齡無破損鴨胚進行細菌分離鑒定，結果發現 245枚存在細菌感染，其中大腸桿菌、沙門氏菌和奇異變形桿菌分別占38.30%、26.24%和8.16%，是死亡鴨胚中的主要致病菌群。以上研究結果為弄清本次種孔雀孵化場發生胚胎死亡、孵化率降低、弱雛率升高等情況提供了很好的借鑒。

本次試驗未開展病死孔雀胚中病毒的分離鑒定，因此，此次該孔雀孵化場疫情的發生不排除可能會有病毒的參與。李清等隨機選取送檢的死亡雞胚80枚進行病毒檢測，結果ALV、REV和CIAV檢出率依次為6.12%、4.49%和2.86%，關于孔雀胚中相關病毒性病原的報道較少，還需要進一步的研究證實[23]。

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