不同解凍方法對冰蛋黃功能特性、理化特性及蛋白質結構的影響

杜清普，趙 英，王瑞紅，遲玉杰,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學農學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

雞蛋質優價廉，富含蛋白質、脂質、維生素以及各種微量礦物質元素，是一種營養豐富且均衡的動物性食品，深受世界各國消費者的青睞。蛋黃作為雞蛋中營養價值更高的部分，因具有良好的功能特性和諸多免疫活性物質而廣泛應用于食品、制藥和生命科學等領域[1]。

冰蛋黃是以鮮雞蛋經清洗、去殼后分離出的蛋黃為原料，經過勻漿、過濾、巴氏殺菌等一系列加工工藝，最后冷凍處理而成的蛋制品。冷凍作為食品貯藏保鮮技術之一，不僅可以最大限度地保留蛋黃的營養成分，而且可以有效延長其貨架期。然而，Moran[2]研究指出低溫冷凍會破壞蛋黃蛋白質的結構并使其變性，進而使蛋黃流動性不可逆地降低，降低程度受冷凍溫度、冷凍時間等條件的影響。閆崢蓉等[3]研究表明，相比于鮮蛋黃，凍藏180 d的蛋黃經自然解凍后自由水含量降低，黏性系數、表面疏水性增大。Liu Jingyuan等[4]用凍融后的蛋黃加熱制備凝膠時發現，凍融蛋黃的彈性模量、黏性模量及最低成膠溫度均高于鮮蛋黃。Harrison等[5]研究發現在90 d凍藏期內，自然解凍后蛋黃的乳化性表現出先下降、后回升、再略微下降的變化規律。

凍融對蛋黃功能特性的影響會使其在食品工業中的加工應用受到限制，合理運用解凍技術是解決此問題的有效途徑之一。目前，食品工業中常采用的解凍方法有自然解凍、低溫解凍、靜水解凍、流水解凍和微波解凍等，多應用于水產品、畜產品的加工與研究[6-8]。然而，關于解凍方法或解凍條件對蛋黃品質的影響卻鮮見報道。本研究采用室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍、微波解凍4 種方法，對比分析了各解凍方法對冰蛋黃乳化特性、凝膠特性等主要功能特性的影響，并探究解凍后蛋黃理化特性和蛋白質結構的變化，旨在選出一種適用于冰蛋黃的解凍方法，從而減少凍融對蛋黃品質的劣變影響，并進一步改善蛋黃的功能特性，同時為冰蛋黃的解凍方法在不同應用需求下的選擇提供參考，并為其工業化生產利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褐殼雞蛋購于哈爾濱市忠君連鎖超市，4 ℃冷藏備用；自采購日起，雞蛋冷藏時間不超過7 d。

乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；考馬斯亮藍G-250染液、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9012型電熱恒溫箱、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；KQ3200DE型數控超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司；NN-GD576M型微波爐 日本松下微波爐有限公司；T18型高速勻漿機 德國IKA公司；TGL-20B型高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TA.XT plus型質構分析儀 英國Stable Micro Systems公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀 英國Marlven公司；F-4700型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；inVia型激光顯微拉曼光譜儀 英國Renishaw公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備與處理

鮮蛋清洗、去殼后分離出蛋黃，用鑷子挑除系帶，將其在濾紙上輕輕滾動以清除卵黃膜表面殘余的蛋清，然后劃破卵黃膜使蛋黃流出。300 r/min攪拌蛋黃10 min后，過濾以除去殘留的卵黃膜。將其在恒溫箱60.6 ℃下殺菌處理3.5 min后冷卻至室溫，得到鮮蛋黃。取30 mL鮮蛋黃置于經過相同條件殺菌處理的50 mL離心管中，在－18 ℃下冷凍6 h得到冰蛋黃。參照表1中的實驗方法對冰蛋黃進行解凍處理。

表1 冰蛋黃的4 種解凍方法Table 1 Four thawing methods for frozen egg yolk

1.3.2 解凍復溫曲線的測定

取出經過冷凍處理的30 mL冰蛋黃，對其進行室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍時，將熱電偶溫度計探頭插于蛋黃幾何中心，實時測定蛋黃中心溫度；進行微波解凍時，將光纖測溫儀傳感光纖插于蛋黃幾何中心測定溫度。

1.3.3 濁度與蛋白質溶解性的測定

濁度根據Kurisaki等[9]的方法進行測定。用0.15 mol/L NaCl溶液配制0.5 g/100 mL蛋黃溶液，漩渦振蕩1 min使其充分溶解。以0.15 mol/L NaCl溶液為對照組，使用紫外分光光度計測定660 nm波長處的吸光度，以此表示為濁度。

蛋白質溶解性參照孫燕婷等[10]的方法測定。取上述0.5 g/100 mL蛋黃溶液，10 000 r/min離心3 min。取200 μL上清液加至4 mL考馬斯亮藍G-250染液，靜置20 min。以200 μL 0.15 mol/L NaCl溶液混合4 mL考馬斯亮藍G-250染液為對照組，測定595 nm波長處的吸光度。根據蛋白質標準曲線計算蛋黃溶液的可溶性蛋白質量濃度，單位mg/mL，以可溶性蛋白質量濃度表示蛋白溶解性。

1.3.4 乳化特性的測定

乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）、乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）參照Pearce[11]和Jiang Shanshan[12]等的方法測定，并略作調整。用0.15 mol/L NaCl溶液配制0.5 g/100 mL蛋黃溶液，漩渦振蕩1 min。取20 mL蛋黃溶液加入5 mL大豆油（水相與油相體積比為4∶1），10 000 r/min均質1 min后立即從底部吸取0.5 mL乳狀液移入49.5 mL的0.1 g/100 mL SDS溶液中，漩渦振蕩10 s。以0.1 g/100 mL SDS溶液作為對照組，測定500 nm波長處的吸光度A0。根據式（1）計算EAI。

式中：n為乳狀液稀釋倍數；ρ為蛋黃質量濃度/（mg/mL）；b為光程（1 cm）；φ為油相體積分數（0.2）。

距初次吸取乳狀液5 min后重復上述步驟，測得吸光度A5min。根據式（2）計算ESI。

式中：Δt為間隔時間5 min。

1.3.5 凝膠特性的測定

參考毋引子等[13]的方法進行質構剖面分析（texture profile analysis，TPA），使用質構儀和P/0.5型探頭測定蛋黃的凝膠特性。取30 mL蛋黃于50 mL燒杯中，85 ℃水浴加熱20 min制備凝膠，室溫冷卻12 h后測定其凝膠強度和凝膠硬度。測試參數設置為測前速率5 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率5 mm/s、行進距離10 mm、觸發力5 g。

1.3.6 質構特性的測定

參考Ramaswamy等[14]的方法，通過反擠壓流變學利用質構儀、A-BE型探頭測定蛋黃的硬度、稠度、內聚性及黏性。測試參數設置為測前速率5 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率2 mm/s、行進距離15 mm、觸發力5 g。

1.3.7 粒徑及其分布的測定

取一定量的蛋黃用超純水稀釋10 倍，漩渦振蕩至充分溶解。參照Campbell等[15]使用Mastersizer 2000型粒度分析儀測定D4,3、d0.1、d0.5、d0.9及粒徑分布曲線。其中，D4,3表示體積平均粒徑，d0.1、d0.5、d0.9分別指體積占比累計10%、50%、90%的平均粒徑。測試參數設置為顆粒折射率1.460、分散劑折射率1.330、粒徑檢測范圍0.02～2 000 μm。

1.3.8 表面疏水性的測定

表面疏水性參考Shen Xue等[16]的方法，利用ANS作為熒光探針進行測定。用1×PBS（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）配制8 mmol/L ANS溶液和質量濃度依次為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的蛋黃溶液。10 000 r/min離心3 min，取4 mL上清液加入至20 μL ANS溶液并立刻漩渦振蕩5 s，然后避光靜置反應20 min。使用熒光分光光度計測定熒光強度，測試參數設置為激發波長390 nm、發射波長470 nm、狹縫寬度3.0 nm。以濃度為橫坐標、熒光強度為縱坐標繪制擬合曲線，以擬合曲線斜率作為表面疏水性指數（H0），以H0表征表面疏水性。

1.3.9 巰基與二硫鍵含量的測定

參考Beveridge等[17]的方法，利用Ellman試劑測定蛋黃游離巰基、表面巰基以及二硫鍵含量。用Tris-Gly緩沖液（含0.086 mol/L Tris、0.1 mol/L Gly及4 mmol/L EDTA，用HCl調pH值至8.0）配制1 g/100 mL蛋黃溶液，漩渦振蕩3 min。避光條件下用Tris-Gly緩沖液配制4 mg/mL DTNB溶液，即得Ellman試劑。取0.1 mL Ellman試劑加入至5 mL蛋黃溶液，室溫下避光反應20 min后，5 000 r/min離心15 min后取上清液。以0.1 mL Ellman試劑混合5 mL Tris-Gly緩沖液為對照組，測定上清液于412 nm波長處的吸光度A412nm。根據式（3）計算蛋黃游離巰基含量。

式中：n為蛋黃溶液稀釋倍數；ρ為蛋黃質量濃度/（mg/mL）。

Tris-Gly緩沖液加入8 mol/L尿素制得Urea-Tris-Gly緩沖液，再加入10 mmol/Lβ-巰基乙醇制得βME-Urea-Tris-Gly緩沖液，用Urea-Tris-Gly緩沖液和βME-Urea-Tris-Gly緩沖液分別替代Tris-Gly緩沖液重復上述方法分別測定上清液A412nm，并按照公式（3）計算表面巰基含量、總巰基含量。根據式（4）計算二硫鍵含量。

1.3.10 拉曼光譜的測定與分析

參考Herrero等[18]的方法，將蛋黃均勻涂抹于載玻片上用于拉曼光譜掃描。測試參數為：拉曼頻移范圍400～2 000 cm－1，激發波長532 nm，發射功率50 mW，峰位誤差小于3 cm－1，以苯丙氨酸峰位歸屬（1 003±1）cm－1作為歸一化因子。運用OMINIC軟件校準拉曼光譜基線、檢測峰位歸屬，采用PeakFit 4.12軟件定量分析蛋白質二級結構的相對含量。

1.4 數據分析與處理

每組數據平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示。運用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行統計分析，數據平均值的多重比較采用Duncan法，并進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05表示差異顯著。采用OriginPro 9.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 各解凍方法下冰蛋黃的復溫曲線

冰蛋黃在室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍及微波解凍方法下復溫至25 ℃所需時間依次縮短，分別為213.5、37.5、21.0、0.5 min（圖1）。在室溫自然解凍、靜水浴解凍、超聲波解凍的過程中，蛋黃中心溫度升至（－0.7±0.1）℃時變化趨勢較為平緩，表明此時蛋黃正在進行由固相至液相的相轉變。Lopez等[19]的研究也指出蛋黃的凝固點為－0.65 ℃。相比于室溫自然解凍，靜水浴解凍的復溫時間縮短了82.44%。這是因為在同等溫度、壓力及自然對流等條件下，水的對流換熱系數和導熱系數均大于空氣，故靜水浴的熱傳遞作用更強，解凍所需時間較短[20]。超聲波解凍的復溫時間為靜水浴解凍復溫時間的56.00%，可能是超聲波通過機械效應與空化作用使分子處于機械振動狀態，瞬間產生高溫、高壓條件，繼而加速復溫過程[21]。4 種解凍方法中，微波解凍的復溫速率最快。然而進行微波解凍時，蛋黃內產生局部凝膠化的現象，解凍后有少量凝膠微粒形成。這是因為蛋黃內部部分冰晶先于其他冰晶融化成極性水分子，加劇了微波的吸收。譚明堂等[8]也發現魷魚在微波解凍下呈現局部燒焦的現象。

圖1 各解凍方法下冰蛋黃的復溫曲線Fig.1 Rewarming curves of frozen egg yolk with different thawing methods

2.2 解凍方法對蛋黃濁度與蛋白質溶解性的影響

蛋白質溶解性是反映蛋黃水合性質的重要指標，也是評價其功能特性的基礎指標；濁度則能直觀反映蛋黃組分的聚集、交聯程度。本研究以蛋黃溶液的吸光度表示濁度，以其中可溶性蛋白的質量濃度表示蛋白質溶解性。

如圖2所示，室溫自然解凍后蛋黃的濁度最高（1.78），且可溶性蛋白的質量濃度最低，僅為0.298 mg/mL。這表明冷凍使低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）及其他可溶性蛋白結構遭到破壞，疏水基團暴露并發生疏水相互作用從而形成聚集體，宏觀表現為水溶性的降低[22]。同時，這也表明蛋白質溶解性與濁度呈一定的負相關性。靜水浴解凍下蛋黃的可溶性蛋白質量濃度僅高于室溫自然解凍蛋黃，且與鮮蛋黃無顯著性差異（P＞0.05），說明加快復溫速率可以起到減緩冷凍致使LDL變性聚集的作用。蛋黃經過超聲波解凍和微波解凍后的可溶性蛋白質量濃度無顯著性差異（P＞0.05），相對于鮮蛋黃分別提高10.73%、14.39%。這表明在微波的影響下，蛋白質聚集體因次級鍵遭到破壞而分散，其內部的極性基團得以暴露，從而使溶解性增強；超聲波則通過機械作用產生空穴效應，使聚集體結構逐漸疏松，更多的極性基團接觸到水相，疏水性多肽朝向脂質部分，最終使其溶解性增強[23]。張春紅等[24]的研究也表明短期微波處理可以增強大豆分離蛋白質溶解性，溶解性隨處理時間延長而上升。

圖2 解凍方法對蛋黃濁度與蛋白質溶解性的影響Fig.2 Effects of thawing methods on turbidity and protein solubility of egg yolk

2.3 解凍方法對蛋黃乳化特性的影響

EAI和ESI是評價蛋黃乳化性的兩個重要參數。EAI反映乳化劑在油、水兩相中自由擴散并吸附于兩相界面處使兩相間接“相溶”的能力；ESI則反映乳化劑易于在油-水界面附著，維持乳狀液體系穩定的能力[23]。

由圖3可知，蛋黃的乳化活性與蛋白質溶解性的變化趨勢基本相同，表明EAI與可溶性蛋白質量濃度具有一定的正相關性。相比于鮮蛋黃，蛋黃在室溫下自然解凍后EAI降低10.65%、ESI降低6.98%，且均顯著低于其他解凍方法（P＜0.05）。靜水浴解凍后蛋黃的EAI與鮮蛋黃的差異不顯著（P＞0.05），但ESI顯著高于鮮蛋黃（P＜0.05）。超聲波解凍和微波解凍下蛋黃的EAI分別為8.54、8.61 m2/g，雖然兩者均較高且無顯著性差異（P＞0.05），但超聲波解凍后蛋黃的ESI顯著高于微波解凍（P＜0.05）。這可能是因為超聲波處理使油-水界面處蛋白質與油相的疏水相互作用力增強，親水基團進入水相使兩相界面的界面張力減小，導致被包埋的油滴難以聚集；也可能是蛋黃經過微波解凍后粒徑分布不均，乳狀液體系自身紊亂所致[25]。李楊等[26]的研究也發現利用超聲處理可以有效改善大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩定性。

圖3 解凍方法對蛋黃乳化活性與乳化穩定性的影響Fig.3 Effects of thawing methods on emulsifying activity and emulsion stability of egg yolk

2.4 解凍方法對蛋黃凝膠特性的影響

凝膠特性是反映蛋白質變性、交聯的宏觀特征之一。凝膠的形成既依賴于蛋白質分子之間的共價鍵相互作用，也與蛋白質和水的偶極-偶極相互作用有關。凝膠強度的差異性取決于蛋白質分子質量分布、氨基酸組成以及肽鏈長度的差異性[27]。

如圖4所示，蛋黃經過冷凍并在室溫下自然解凍后，所制備熱凝膠的凝膠強度下降11.75%。靜水浴解凍、超聲波解凍后蛋黃的凝膠強度和凝膠硬度都處于較低水平，且差異均不顯著（P＞0.05）。微波解凍下蛋黃的凝膠強度介于鮮蛋黃和室溫自然解凍之間，但其凝膠硬度超出鮮蛋黃9.41%并顯著高于其他解凍方法（P＜0.05）。這說明在微波輻照的影響下，蛋黃蛋白質構象發生改變使疏水基團暴露，并通過共價作用和疏水相互作用形成膠束，最終形成三維凝膠網絡[28]。這也與微波解凍導致蛋黃局部產生凝膠微粒的現象相吻合。閆虹等[28]的研究也指出微波處理可使白鰱魚糜的凝膠特性得到有效提高。

圖4 解凍方法對蛋黃凝膠強度與凝膠硬度的影響Fig.4 Effects of thawing methods on gel strength and hardness of egg yolk

2.5 解凍方法對蛋黃質構特性的影響

凍融后的蛋黃形態為半固態，在縱向剪切力的作用下，其橫截面產生屈服應力并宏觀表現出一定的黏性、彈性等質構特性。反擠壓流變學已用于多項觸變性流體、半固體等樣品的研究[14,29]。依據反擠壓流變學對蛋黃質構特性進行測定，結果可以直觀地反映出蛋黃蛋白質的變性程度。

從表2可以看出，室溫自然解凍對蛋黃流動性的影響最大，該方法解凍后蛋黃的硬度、稠度、內聚性及黏性均顯著高于鮮蛋黃和其他解凍方法（P＜0.05）。其次是靜水浴解凍，該方法下蛋黃的黏性是鮮蛋黃的4.66 倍。超聲波解凍后蛋黃的硬度、稠度、黏性與內聚性均高于鮮蛋黃，但差異均不顯著（P＞0.05）。相比于鮮蛋黃，微波解凍使蛋黃的硬度、內聚性顯著增大（P＜0.05），分別提高1.59、2.36 倍。相對于其他3 種解凍方法，室溫自然解凍下蛋黃的質構特性變化較大，究其原因，可能是靜水浴解凍、超聲波解凍及微波解凍均使冰蛋黃中蛋白質分子的運動加劇，創造出有利于因凍融而形成的共價鍵斷裂的條件，同時蛋白質分子難以穩定接觸并發生相互作用，最終使蛋黃流動性增強[30]。

表2 解凍方法對蛋黃質構特性的影響Table 2 Effects of thawing methods on textural properties of egg yolk

2.6 解凍方法對蛋黃粒徑及其分布的影響

2.6.1 解凍方法對蛋黃粒徑的影響

各解凍方法下蛋黃的平均粒徑如表3所示。其中D4,3顯示出蛋黃在室溫下自然解凍后的粒徑整體較大，而采用其他方法進行解凍可以對D4,3增加起到不同程度的抑制效果。鮮蛋黃的d0.1、d0.5、d0.9分別為4.56、25.44、47.12 μm，通過比較鮮蛋黃和經室溫自然解凍處理的蛋黃粒徑可以發現，凍融處理使d0.1減小69.96%、d0.5減小46.50%，而d0.9增大3.77 倍，表明凍融過程中所形成的大粒徑顆粒是由小粒徑顆粒聚集而成，進一步印證了室溫自然解凍下蛋黃濁度較大的研究結果。Au等[31]也報道了冷凍處理會使蛋黃“顆?！苯M分的粒徑增大、凝膠性增強，并且這是由脂蛋白或載脂蛋白在低溫環境中發生交聯聚集所致。相比于室溫自然解凍，微波解凍后蛋黃的平均粒徑較小，其D4,3為10.76 μm。張海華等[32]利用微波處理小麥面筋蛋白時也得到了平均粒徑減小的結果。微波解凍下蛋黃的d0.1、d0.5均顯著小于超聲波解凍（P＜0.05），但其d0.9達到28.54 μm，為后者的1.94 倍，表明微波解凍下蛋黃中有凝膠微粒初步形成。

表3 解凍方法對蛋黃粒徑的影響Table 3 Effects of thawing methods on particle size of egg yolk

2.6.2 解凍方法對蛋黃粒徑分布的影響

圖5反映了蛋黃經不同解凍方法處理后粒徑分布的情況。室溫自然解凍后蛋黃的粒徑分布較為分散，且在100～1 000 μm范圍內檢測出大量顆粒。Relkin等[33]指出乳狀液的平均粒徑越小，粒徑分布越均勻，其乳化性越好，這解釋了室溫自然解凍下蛋黃乳化性較差的原因。與室溫自然解凍相比，靜水浴解凍后蛋黃的粒徑分布趨于集中，說明用靜水浴解凍后的蛋黃制備出的乳狀液更加穩定。超聲波解凍后蛋黃的粒徑分布較為均勻，幾乎呈單峰且近似于正態分布，因此在該解凍方法下蛋黃制備出的乳狀液體系穩定性最好[34]。微波解凍后蛋黃的D4,3與超聲波解凍的差異不顯著（P＞0.05），但微波解凍下蛋黃的粒徑分布呈現雙峰，印證了微波解凍下蛋黃的乳化活性與超聲波解凍無顯著性差異（P＞0.05），乳化穩定性卻顯著低于超聲波解凍（P＜0.05）的結果。

圖5 解凍方法對蛋黃粒徑分布的影響Fig.5 Effects of thawing methods on particle size distribution of egg yolk

2.7 解凍方法對蛋黃表面疏水性的影響

表面疏水性指數能夠反映蛋白質表面所暴露疏水性氨基酸殘基的相對含量，其越大表示蛋白質構象展開程度越大[35]。由圖6可知，鮮蛋黃H0為3 873.30，而蛋黃經過冷凍并在室溫下自然解凍后增至4 835.30。這是由蛋黃經過冷凍處理后蛋白質構象發生改變，使包埋在內部的疏水性氨基酸殘基暴露所致。彭歡歡等[36]在研究凍藏期間河蟹肌原纖維蛋白生化特性的變化時，發現肌原纖維蛋白的表面疏水性隨冷凍時間延長而上升。靜水浴解凍后蛋黃的H0最高（5 079.63）（P＜0.05），相比于鮮蛋黃增大31.14%。這進一步表明冰蛋黃在室溫下自然解凍時，脂蛋白構象發生改變，導致其脂質部分伸出蛋白質表面，形成疏水環境，因蛋白質變性而暴露的疏水基團之間發生疏水相互作用，使得表面疏水性有所降低；而靜水浴解凍削弱了蛋白質表面疏水基團的相互作用[3,37]，因此該解凍方法下蛋白質的表面疏水性較強。超聲波解凍和微波解凍后蛋黃的H0均顯著低于其他解凍方法（P＜0.05），且兩者無顯著性差異（P＞0.05），印證了這兩種解凍方法下蛋白質溶解性較高的研究結果。梁雯雯等[38]的研究也指出微波解凍下鰱魚肌球蛋白的表面疏水性低于靜水解凍。

圖6 解凍方法對蛋黃表面疏水性的影響Fig.6 Effects of thawing methods on surface hydrophobicity of egg yolk

2.8 解凍方法對蛋黃巰基與二硫鍵含量的影響

作為半胱氨酸的活性殘基，巰基易于氧化形成二硫鍵，對蛋白質構象的形成與改變發揮著至關重要的作用[39]。各解凍方法對蛋黃游離巰基、表面巰基及二硫鍵含量的影響如圖7所示。室溫自然解凍下蛋黃的游離巰基含量最低，僅為3.07 μmol/g，相比于鮮蛋黃減少了36.96%，而二硫鍵含量最高（11.71 μmol/g），相比于鮮蛋黃增加了17.33%。這表明在凍融處理的影響下，蛋黃蛋白質分子之間的巰基氧化結合形成二硫鍵。Chen Zhenjia等[40]研究指出巰基含量的減少也可能是其發生氧化重排形成其他氧化產物所致。超聲波解凍后蛋黃游離巰基、表面巰基的含量與微波解凍近似，但超聲波解凍下蛋黃的二硫鍵含量顯著低于微波解凍（P＜0.05），表明超聲波作用可使蛋黃總巰基含量減少。李弓中等[41]的研究表明蛋清液的總巰基含量隨超聲時間延長呈下降的趨勢。通過對比各解凍方法下蛋黃的表面巰基含量與可溶性蛋白質量濃度的結果可以發現兩者呈現出一定的正相關性，說明巰基與水分子之間的氫鍵作用也是影響蛋白質溶解性的因素之一。

圖7 解凍方法對蛋黃巰基與二硫鍵含量的影響Fig.7 Effects of thawing methods on contents of sulfhydryl groups and disulfide bonds in egg yolk

2.9 各解凍方法下蛋黃的拉曼光譜及蛋白質二級結構相對含量

2.9.1 各解凍方法下蛋黃的拉曼光譜

拉曼激光經過分子產生非彈性散射時，其波長、頻率會發生改變，散射光與激發光的光頻差稱為拉曼頻移。拉曼頻移取決于分子振動或轉動能級的變化，因此拉曼光譜可用于分子結構的純定性或高度定量分析。在拉曼光譜中，有酰胺III帶（波數1 230～1 350 cm－1）、酰胺I帶（波數1 600～1 700 cm－1）以及所包含的肽鍵C＝O伸縮振動帶、N—H彎曲振動帶（波數1 665 cm－1）等以拉曼光強的形式反映出的蛋白質二級結構信息，也有諸如色氨酸吲哚環（波數759 cm－1）、酪氨酸殘基（波數830 cm－1和850 cm－1）等所處微環境變化的反饋信息[34]。依據譜峰的峰位歸屬，可以對經過不同方法解凍的蛋黃蛋白質構象變化情況進行分析，從而深入了解各解凍方法影響蛋黃功能特性的作用機制。

由圖8可知，各方法解凍后的蛋黃均在波數1 004 cm－1附近呈現高強度譜峰（歸屬于苯丙氨酸苯環伸縮振動），該譜峰因受外界環境影響較小而常被用作歸一化因子。冰蛋黃于室溫下自然解凍后脂蛋白烷基鏈C＝C伸縮振動（波數1 522 cm－1附近譜峰）強度與鮮蛋黃相比有所減弱，這可能是因為蛋白質C＝C與水分子—OH基共價結合使其含量減少所致[42]。超聲波解凍、微波解凍后的蛋黃均在波數1 157 cm－1和1 443 cm－1附近呈現拉曼光譜峰強度高于鮮蛋黃的譜峰（歸屬于脂肪族氨基酸非對稱C—H彎曲振動），而室溫自然解凍和靜水浴解凍下該譜峰強度均略低于鮮蛋黃，表明低溫冷凍使蛋白質發生變性聚集的同時，脂肪族疏水性基團被包埋于蛋白質分子內部，繼而導致C—H振動強度減弱，拉曼頻移減小，并且該過程受靜水浴快速復溫的影響而有所緩和；微波、超聲波則是利用機械效應使分子運動加劇，對聚集體結構分別進行不同程度的破壞，將處于包埋狀態以及原有的疏水性基團暴露至極性微環境下[34]，最終使譜峰強度恢復并高于鮮蛋黃。該研究結果與各解凍方法對蛋黃蛋白質溶解性、乳化性影響的研究結果表現出高度一致性。

圖8 各解凍方法下蛋黃的拉曼光譜Fig.8 Raman spectra of frozen egg yolk thawed by different thawing methods

2.9.2 解凍方法對蛋黃蛋白質二級結構相對含量的影響

蛋白質分子中肽鍵之間的氫鍵、分子間的范德華力等次級鍵是使其二級結構保持穩定的主要作用力。低溫、超聲波及微波作用會使次級鍵發生斷裂，導致蛋黃蛋白質原有二級結構被破壞，進而重排形成新的蛋白質分子構象。有研究指出，在拉曼光譜酰胺I帶中：波數1 626～1 638 cm－1拉曼譜帶歸屬于β-折疊；波數1 640～1 648 cm－1拉曼譜帶歸屬于無規卷曲；波數1 648～1 657 cm－1拉曼譜帶歸屬于α-螺旋；波數1 673～1 686 cm－1拉曼譜帶歸屬于β-轉角[43-44]。通過對酰胺I帶內不同譜帶的拉曼曲線峰面積進行積分，可計算出蛋白質4 種二級結構的相對含量。

如表4所示，α-螺旋是蛋黃蛋白質中含量最高的二級結構，在鮮蛋黃中相對含量為34.80%。對比微波解凍后的蛋黃和鮮蛋黃可知，微波解凍使蛋黃α-螺旋相對含量顯著減少（P＜0.05），并向其他結構轉化。郝天舒等[45]在研究微波處理對米糠蛋白二級結構影響時得到了相同的結果。Blume等[46]也指出α-螺旋含量的減少有利于凝膠三維網絡的形成，這解釋了微波解凍下蛋黃凝膠硬度較大這一現象。蛋黃經冷凍并在室溫下自然解凍后，氫鍵含量較多、結構規則有序的β-折疊結構相對含量顯著增多（P＜0.05），解釋了蛋黃經過凍融后流動性較低，內聚性、黏性等質構特性較高的現象。冰蛋黃經超聲波解凍處理后，β-折疊相對含量由19.27%降低至16.08%，無規卷曲相對含量由17.02%增加至20.59%，這與李弓中等[41]研究發現蛋清蛋白質β-折疊、無規卷曲含量隨超聲作用時間延長而分別減少、增多的研究結果類似。從β-轉角的結果來看，室溫自然解凍、靜水浴解凍均使其相對含量降低，而超聲波解凍、微波解凍均使其相對含量上升，與蛋黃蛋白質溶解性呈現出一致的規律。這可能是因為β-轉角結構多含有帶電荷的極性氨基酸殘基，且該結構常出現于球狀蛋白表面，有利于使蛋白質結構更加松散，故β-轉角含量越高，蛋白質溶解性越強[47]。

表4 解凍方法對蛋黃蛋白質二級結構相對含量的影響Table 4 Effects of thawing methods on protein secondary structures in egg yolk

3 結 論

本研究結果表明不同解凍方法對冰蛋黃的蛋白質溶解性、乳化特性、凝膠特性及表面疏水性等功能、理化特性有不同程度的影響，并證明超聲波解凍是較適用于冰蛋黃的解凍方法。

室溫自然解凍下冰蛋黃的復溫時間最長，為213.5 min。該方法解凍后蛋黃的濁度最高（1.78），二硫鍵含量最高（11.71 μmol/g），且蛋白質二級結構中β-折疊相對含量最高，表明該解凍方法下蛋白質的交聯聚集程度最高。靜水浴解凍后蛋黃的乳化活性、乳化穩定性均顯著低于超聲波解凍（P＜0.05），并且該解凍方法下蛋黃的表面疏水性最強，相比于鮮蛋黃增大31.14%。冰蛋黃經超聲波解凍后D4,3最?。?.69 μm），且粒徑分布最為集中。該解凍方法下蛋黃的硬度、內聚性、黏性等質構特性均較低且與鮮蛋黃無顯著性差異（P＞0.05）。而且與鮮蛋黃相比，超聲波解凍后蛋黃的蛋白質溶解性、乳化活性、乳化穩定性均有所改善。微波解凍下冰蛋黃的復溫時間最短，僅為0.5 min。但該解凍方法下蛋黃的二硫鍵含量顯著高于超聲波解凍（P＜0.05），且粒徑分布較為分散，蛋白質α-螺旋結構相對含量最低，解凍后蛋黃中有凝膠微粒形成。