葉酸和辛烯基琥珀酸酐雙修飾菊粉膠束對姜黃素的荷載特性

李若華，楊 華，雷 琳,2，葉發銀,2，趙國華,2,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

姜黃素是從姜黃（Curcuma longaL.）中提取出來的一種黃色多酚類化合物（圖1），具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤的效果[1]。但姜黃素不溶于水，對光、熱敏感，在堿性條件下極不穩定，因此姜黃素生物利用度不高，其在食品和藥品領域的應用也受到了限制。具備殼-核結構的兩親性多糖自聚集膠束常被用作食品功能成分的輸送體系來提高脂溶性活性物質的生物利用度及穩定性[2]。兩親性多糖是指通過特定化學反應，將疏水性基團導入天然水溶性多糖而獲得的兩親性產物，具有良好的生物降解性，且安全無毒。近年來透明質酸、菊粉和殼聚糖等多糖及其衍生物經疏水化改性后常用于制備安全穩定的膠束給藥體系[3-5]。目前，多種材料已應用到姜黃素聚合物膠束的制備當中。Stanciu等[6]以右旋糖酐和脫氧膽酸為原料制備的兩親性嵌段共聚物在水介質中形成粒徑50～600 nm的球狀膠束聚集體，使荷載姜黃素的溶解度提高了68 181 倍，藥物釋放緩慢。Sajomsang等[7]發現，經N-芐基化和N-O-琥珀?；纬傻膬捎H性殼聚糖，自組裝膠束粒徑?。?00 nm），在4 ℃和25 ℃環境中具有良好的貯藏穩定性，是一種有效的口服姜黃素給藥載體。此外，具有pH[8]和溫度[9]敏感性的荷載姜黃素聚合膠束應運而生，它們能在特定的作用部位快速釋放姜黃素達到有效濃度，起到靶向治療作用。

圖1 姜黃素化學結構式Fig.1 Chemical structure of curcumin

對自組裝膠束外殼進行化學修飾可實現主動靶向功能，提高膠束對靶細胞的主動識別和靶向能力。葉酸受體是一種分布在細胞表面的膜蛋白，在大部分上皮腫瘤細胞呈高水平表達，如子宮癌、卵巢癌、結腸癌、乳腺等細胞[10]。作為水溶性B族維生素的成員之一，葉酸分子質量小、易于修飾和穿透腫瘤細胞、免疫原性低，其修飾的載藥膠束能被高效導入腫瘤細胞[11]。研究表明，通過對膠束進行葉酸修飾能更有效地靶向腫瘤細胞，提高制劑對腫瘤細胞的殺傷作用[12]。對于葉酸受體表達過量的人宮頸癌HeLa細胞和口腔鱗癌KB細胞，葉酸修飾載藥膠束的細胞攝取及細胞毒性均明顯強于普通載藥膠束。動物實驗進一步表明，葉酸修飾載藥膠束的平均抑瘤率比普通載藥膠束高16%[13]。

鑒于葉酸修飾載藥膠束的特點，如能構建葉酸主動靶向運輸體系，高效穩定地向結腸輸送姜黃素，將有益于人體腸道健康。因此本研究以辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）為疏水改性劑，菊粉為天然水溶性多糖，制備葉酸和OSA雙修飾菊粉（folic acid octenylsuccinate inulin，FA-OS-菊粉）膠束，對荷載姜黃素的穩定性和釋放特性進行評價，以期為葉酸修飾荷載姜黃素膠束在食品工業中應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊粉（果聚糖質量分數≥90%，重均摩爾質量2751 g/mol） 白銀希瑞生物工程有限公司；OSA、P7000胃蛋白酶、P7545胰酶 美國Sigma-Aldrich公司；葉酸（純度＞97%），姜黃素（純度＞98%），N,N'-羰基二咪唑（N,N'-carbonyldiimidazole，CDI）上海Adamas試劑公司；K2HPO4、KH2PO4、NaCl、羧甲基纖維素鈉 成都市科龍化工試劑廠；透析袋（截留分子質量1 000 kDa） 美國Union Carbide公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Zetasizer Nano ZS90動態散射光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；F2 500熒光分光光度計 日本日立儀器有限公司；HWS-26恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；T 25 ULTRA-TURRAX高速分散儀 德國IKA公司；HJ-4A磁力攪拌器 金壇市科析儀器有限公司；TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；QL-866漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Spectrum 100紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer公司；AV 600核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 不同菊粉基樣品的制備

參照文獻[14]制備OSA修飾菊粉（octenylsuccinate inulin，OS-菊粉）：準確稱取5 g菊粉于90 mL純水并勻速攪拌（300 r/min），逐滴加入1.4 mL質量濃度1 g/mL OSA溶液并用質量分數3%的NaOH溶液維持體系pH值為8～10，45 ℃攪拌5 h后，用質量分數3% HCl溶液將pH值調至6.5，隨后分別用自來水、50%乙醇溶液和純水各透析12 h。透析后的溶液經冷凍干燥后，得到OS-菊粉儲存在－80 ℃備用。按照Dan Qiu等[15]的方法，檢測樣品的OSA取代度（octenylsuccinate substitution degree，DSO）。

參照文獻[16]制備FA-OS-菊粉：將近似等物質的量的葉酸（0.001 1 mol）和稍過量的催化劑CDI（0.001 2 mol）溶解于盛有15 mL無水二甲基亞砜的具塞錐形瓶中，25 ℃、250 r/min下振蕩14 h，得到葉酸活性酯。將上述OS-菊粉和10.83 mL葉酸活性酯混勻，25 ℃、250 r/min下振蕩5.45 h后，加入4 倍體積丙酮攪拌均勻后室溫避光靜置12 h?；旌弦弘x心（4 000 r/min、20 min）后所得沉淀溶解于20 mL 1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中，分別用磷酸緩沖鹽溶液、自來水和純水各透析24 h（每6 h更換一次溶液）。透析后的溶液經冷凍干燥后得到FA-OS-菊粉，儲存于－80 ℃備用。檢測樣品DSO后，按照Dubé等[17]的方法檢測樣品葉酸取代度（folic acid substitution degree，DSF）。

制備葉酸-菊粉（folic acid-inulin，FA-菊粉）：將26.06 mL葉酸活性酯和5 g菊粉混勻，25 ℃、250 r/min下振蕩6.19 h，加入4 倍體積丙酮攪拌均勻后室溫避光靜置12 h。參照FA-OS-菊粉制備中離心、溶解、透析、冷凍干燥的方法，得到FA-菊粉并儲存在－80 ℃備用。檢測樣品DSF。

1.3.2 FA-OS-菊粉的結構分析

傅里葉變換紅外光譜分析：取3 mg樣品加入150 mg烘干的溴化鉀粉末研細、混勻、壓模制片，置于紅外光譜儀中進行掃描，波數范圍為500～4 000 cm－1，分辨率為4 cm－1，以實時空氣為空白[18]。

核磁共振氫（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）譜圖分析：參考Muley等[19]的方法，將10 mg樣品溶于1 mL二甲基亞砜-d6，置于核磁共振儀中，在50 ℃，400 MHz條件下進行分析。

1.3.3 臨界膠束濃度的測定

參考Muley等[19]的方法，準確稱取20 mg樣品配制成質量濃度為1.0 mg/mL的自聚集溶液，稀釋成不同質量濃度的溶液，以芘為熒光探針，用熒光分光光度計測定菊粉、OS-菊粉、FA-菊粉和FA-OS-菊粉溶液在300～360 nm波長范圍的激發光譜。發射和激發狹縫分別為10、5 nm，以芘在338 nm和333 nm的熒光強度比（I338/I333）與質量濃度的對數做圖，圖中曲線突變點對應的質量濃度即為臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）。

1.3.4 荷載姜黃素菊粉基膠束溶液的制備

將40 mg菊粉、OS-菊粉、FA-菊粉和FA-OS菊粉分別溶于20 mL的水中，各加入10 mg姜黃素，依次在均質儀中處理2 min（15 000 r/min、1 min；12 000 r/min、1 min），所得分散液在30 ℃下攪拌24 h后離心（8 900 r/min、10 min），收集上清液，即得荷載姜黃素菊粉基膠束溶液。采用高效液相色譜法測定上清液姜黃素質量濃度[20]，按公式（1）計算菊粉基膠束對姜黃素的荷載力。

式中：ρ1表示姜黃素在菊粉基膠束溶液中的質量濃度/（μg/mL）；ρ2表示菊粉基膠束溶液中菊粉基膠束的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 粒徑和多分散性指數的測定

采用動態光散射法測定粒徑和多分散性指數（polydispersity index，PDI）。分別將2 mL荷載姜黃素菊粉基膠束溶液放入動態散射光粒度分析儀樣品池進行測定。測定條件：氬離子激光器，波長633 nm、溫度（25±0.1）℃、散射角90°[20]。

1.3.6 荷載姜黃素FA-OS-菊粉膠束穩定性研究

1.3.6 .1 熱穩定性研究

分別配制不同荷載姜黃素菊粉基膠束溶液于5 mL玻璃具塞試管中，各在50、70、90 ℃下恒溫水浴加熱，分別在10、20、30 min時取出試管，測定樣品粒徑、PDI、姜黃素質量濃度，并按照公式（2）計算姜黃素保留率。

式中：ρt表示一定時間間隔后膠束溶液中姜黃素質量濃度/（μg/mL）；ρ0表示膠束溶液中初始姜黃素質量濃度/（μg/mL）。

1.3.6 .2 凍融穩定性研究

分別配制不同荷載姜黃素菊粉基膠束溶液于玻璃具塞試管中（5 mL），－18 ℃下冷凍22 h后，25 ℃下解凍2 h，以此為一次凍融循環，重復處理5 次。每凍融循環1 次后，測定樣品粒徑、PDI和姜黃素保留率。

1.3.6 .3 貯藏穩定性研究

分別配制不同荷載姜黃素菊粉基膠束溶液于玻璃具塞試管中（5 mL），分別在25、4 ℃下避光貯藏，分別在6、12、18、24、30 d時取出試管，測定樣品粒徑、PDI和姜黃素保留率。

1.3.7 荷載姜黃素FA-OS-菊粉膠束的體外模擬胃腸液消化穩定性及釋放特性

1.3.7 .1 模擬胃腸液消化穩定性研究

按照Wu Zhen等[21]的方法制備模擬胃液（pH 1.2，含3.2 mg/mL胃蛋白酶、2.0 mg/mL NaCl）和模擬腸液（pH 7.0，含10.0 mg/mL胰酶、6.8 mg/mL KH2PO4）。取荷載姜黃素膠束溶液按1∶3（V/V）分別與模擬胃腸液混合（共16 mL）于具塞試管中并充分混勻；恒溫振蕩器處理（150 r/min、37 ℃）。研究模擬胃液消化穩定性時，分別在10、20、30、60、90 min時取出3 mL模擬胃消化液；研究模擬腸液消化穩定性時，分別在30、60、120、240、360 min時取出3 mL模擬腸液。測定樣品粒徑、PDI和姜黃素保留率。

1.3.7 .2 模擬胃腸液釋放特性研究

取2 mL荷載姜黃素菊粉基膠束溶液于試管中，并按照模擬胃腸液鹽離子比例添加相應量的NaCl和KH2PO4，混合均勻后，轉移至透析袋中。將透析袋移至含有體積分數10%吐溫-80溶液的50 mL模擬胃腸液中，恒溫振蕩器處理（150 r/min，37 ℃）。研究模擬胃液釋放特性時，分別在10、20、30、60、90 min時取出1 mL透析袋外液待測，再補充加入1 mL模擬胃液；研究模擬腸液釋放特性時，分別在30、60、120、240、360 min取出1 mL透析袋外液待測，再補充加入1 mL模擬腸液。采用高效液相色譜法測定模擬腸液中姜黃素質量濃度[20]，按照公式（3）計算姜黃釋放率。

式中：ρt表示一定時間間隔后透析袋外液中姜黃素質量濃度/（μg/mL）；ρ0表示透析袋內液中初始姜黃素質量濃度/（μg/mL）；50和2分別為透析袋外液和內液的體積/mL。

1.4 數據處理與分析

每個樣品重復測定3 次，采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，結果均以平均值±標準差表示。采用單因素方差中的Tukey多重比較分析樣品間的顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 FA-OS-菊粉的結構表征結果

2.1.1 傅里葉變換紅外光譜分析

OS-菊粉DSO為0.041；FA-菊粉DSF為0.150；FA-OS-菊粉DSO為0.039，DSF為0.149。3 400、2 931、1 030 cm－1處的吸收峰分別為菊粉中羥基（－OH）、亞甲基（－CH2）的伸縮振動吸收和糖環上醚鍵（C－O－C）的彎曲振動[14]。由圖2可知，與菊粉紅外光譜圖相比，OS-菊粉和FA-OS-菊粉在1 729和1 562 cm－1處出現新吸收峰，其分別歸屬于OSA和菊粉羥基脫水形成的酯羰基（－CO－）振動吸收和羧酸鹽（ROO－）的不對稱拉伸[18,22]。FA-菊粉和FA-OS-菊粉在842.5 cm－1處為葉酸芳香環上＝C－H的特征吸收峰，1 604、1 515 cm－1處新出現的吸收峰歸屬于酯化反應引入的葉酸苯環上的C＝C吸收振動峰[23]。這些吸收峰證實了葉酸和OSA通過酯鍵連接到菊粉分子上。

圖2 菊粉及菊粉酯傅里葉變換紅外掃描圖譜Fig.2 Fourier transform infrared spectra of inulin and its folic acid conjugates

2.1.21H NMR譜圖分析

FA-OS-菊粉的1H NMR譜圖分析如圖3所示，對照為未添加催化劑CDI的FA-菊粉。δ3.14～δ5.16附近的特征峰歸屬于菊粉[14]。δ0.84和δ1.25處的特征峰分別為OS末尾碳原子上氫原子的化學位移和與之相鄰的四個亞甲基的質子位移形成的，δ1.94 處的特征峰屬于OSA中靠近辛烯基雙鍵的碳原子上的質子位移[17]。與OS-菊粉氫譜相比，FA-OS-菊粉的圖譜出現了屬于葉酸的新質子峰：δ6.65和δ7.63分別為葉酸苯環上的兩個鄰位氫，δ8.64處為葉酸蝶啶環的質子峰[24]。結果表明，葉酸已成功修飾FA-OS-菊粉。

圖3 菊粉及菊粉酯1H NMRFig.3 1H Nuclear magnetic resonance spectra of inulin and its folic acid conjugates

2.2 荷載姜黃素膠束的荷載特性

菊粉作為大分子多糖在水和鹽溶液中均具有自聚集性，由表1可知，與菊粉膠束相比，OS-菊粉膠束、FA-菊粉膠束和FA-OS-菊粉膠束的CMC顯著降低，說明改性后膠束的穩定性顯著提升。這可能是因為添加OSA使菊粉的疏水基團增加，導致疏水鏈間的作用增強，促進分子間和分子內疏水區的形成[25]；葉酸分子的羧基被接枝到菊粉分子上，葉酸分子剩余部分的疏水性逐漸增強，在自聚集溶液自組裝形成膠束時，被接枝的葉酸受到的水分子排斥力增強，導致葉酸修飾菊粉疏水性增加，更易于自組裝形成膠束，從而提高了膠束的穩定性[24]。與菊粉膠束相比，OS-菊粉膠束、FA-菊粉膠束和FA-OS-菊粉膠束粒徑和PDI均減小，說明添加OS、葉酸使得膠束粒徑和分散程度更均勻。

表1 菊粉及菊粉酯DSO、DSF和菊粉基膠束姜黃素荷載力及荷載前后膠束粒徑、PDI的變化Table 1 Octenylsuccinate substitution degree and folic acid substitution degree of inulin and modified inulin, and the loading capacity, changes in particle size and PDI of inulin-based micelles before and after curcumin loading

菊粉膠束對姜黃素的增溶作用主要依賴于多糖的親水主鏈，其形成的卷曲、螺旋等結構的非共價結合作用可對姜黃素進行吸附和封裝。荷載姜黃素后，FA-菊粉膠束和FA-OS-菊粉膠束粒徑顯著增加，PDI顯著下降。與菊粉膠束相比，OS-菊粉膠束、FA-菊粉膠束和FA-OS-菊粉膠束的姜黃素荷載力分別提高了9.5、15.4、12.8 倍。OS-菊粉膠束的姜黃素荷載力（3.079 μg/mg）小于OS-燕麥膠束的姜黃素荷載力（4.210 μg/mg）[20]，這可能是因為兩親性多糖結構特性（如取代度和疏水基團長度）不同所致。而葉酸修飾則顯著提高菊粉的姜黃素荷載力（FA-菊粉，4.775 μg/mg；FA-OS-菊粉，4.041 μg/mg）。這可能是因為：1）葉酸接枝降低了膠束CMC，提高了膠束的穩定性；2）葉酸與姜黃素之間的π-π疏水作用和靜電作用更有利于荷載姜黃素。菊粉經葉酸、OSA雙修飾后，取代度之和較大，所形成的膠束使烷基鏈增長，對姜黃素的包埋產生空間位阻效應[20]，因此FA-OS-菊粉對姜黃素的荷載力低于FA-菊粉。

2.3 荷載姜黃素膠束的穩定性

2.3.1 熱穩定性

由表2可知，與0 min相比，熱處理能改變荷載姜黃素菊粉基膠束的粒徑和PDI，破壞膠束結構的完整性。然而，與菊粉膠束相比（90 ℃處理30 min，姜黃素保留率5.40%），OS-菊粉膠束內核的疏水性能保護姜黃素，抑制姜黃素的熱降解（90 ℃處理30 min OS-菊粉，姜黃素保留率29.07%）。葉酸與姜黃素的π-π疏水作用和靜電作用能有效抑制膠束表面姜黃素的遷移[26]，因而葉酸修飾荷載姜黃素膠束能更有效地保留膠束內核姜黃素（90 ℃處理30 min，FA-菊粉姜黃素保留率37.20%，FA-OS-菊粉姜黃素保留率46.60%）。

表2 不同加熱處理下荷載姜黃素菊粉基膠束的粒徑、PDI以及姜黃素保留率變化Table 2 Changes in particle size, PDI and retention of curcumin of inulin-based micelles loaded with curcumin under different heat treatments

2.3.2 凍融穩定性

如圖4所示，隨著凍融次數的增加，荷載姜黃素菊粉膠束的粒徑和PDI不斷增加，而OSA、葉酸修飾能抑制凍融對膠束粒徑和PDI改變。5 次凍融循環后，與菊粉膠束相比（姜黃素保留率14.2%），OSA、葉酸修飾使膠束中的姜黃素的保留率提高到44.2%～66.4%，可有效阻止姜黃素溶出。此外，與OS-菊粉膠束和FA-菊粉膠束相比，FA-OS-菊粉膠束姜黃素保留率較低，這可能是因為凍融處理能促進FA-OS-菊粉膠束內核中姜黃素的溶出。

圖4 凍融循環次數對荷載姜黃素菊粉基膠束粒徑（A）、PDI（B）以及姜黃素保留率（C）的影響Fig.4 Effects of freeze-thaw cycles on the particle size (A), PDI (B), and retention of curcumin (C) of inulin-based micelles loaded with curcumin

2.3.3 貯藏穩定性

由表3可知，隨著貯藏溫度的升高和時間的延長，荷載姜黃素菊粉膠束及其葉酸修飾物膠束的粒徑和PDI均發生改變。PDI在靜置狀態下增加表明膠束在貯藏期間發生了聚集[27]，其分子的動態運動破壞膠束完整性，造成姜黃素泄露氧化。菊粉膠束于4 ℃和25 ℃貯藏30 d后，其姜黃素保留率分別顯著下降至17.27%和12.30%（P＜0.05）；而葉酸修飾能顯著提高膠束內核姜黃素的貯藏穩定性，FA-OS-菊粉膠束于4 ℃和25 ℃貯藏30 d后，其姜黃素保留率分別為65.37%和45.30%。

表3 不同貯藏條件下荷載姜黃素菊粉基膠束的粒徑、PDI和姜黃素保留率的變化Table 3 Changes in particle size, PDI and retention of curcumin of inulin-based micelles loaded with curcumin under different storage conditions

2.4 體外模擬胃腸液對荷載姜黃素膠束的影響

將姜黃素輸送到結腸的主要挑戰之一是其在生理環境中的不穩定性。由圖5、6可知，OSA、葉酸修飾菊粉膠束粒徑在模擬胃液中沒有明顯變化，在模擬腸液中隨時間的延長而增大；PDI在模擬胃腸液中均隨時間的延長而增加。這可能是腸液具有更高的Na+濃度，鹽離子掩蔽或中和膠束表面的電荷，削弱靜電斥力，促進了膠束的靠近、結合，導致膠束粒徑增大，膠束粒徑分布不均勻使得PDI增大[28]。消化結束時，各組姜黃素在模擬胃液中的保留率均在90%以上；在模擬腸液中，除菊粉膠束的姜黃素保留率降低至42.2%，其余膠束的保留率均高于60%。其中，FA-OS-菊粉膠束有明顯的姜黃素保護作用（姜黃素保留率：胃93.1%、腸66.2%）。這可能是葉酸基團的修飾作用屏蔽了一部分Na+，使膠束處于較好的穩定狀態，提高姜黃素的保留率。模擬胃腸液的消化穩定性不同可能與姜黃素的pH敏感性有關[29]。姜黃素的羥基在堿性條件下容易發生脫質子，其降解速率隨pH值增大而增大[30]。因此，膠束內核荷載的姜黃素在腸液中發生嚴重的脫質子現象，導致姜黃素發生自氧化。

由圖5、6可知，與菊粉膠束相比（消化結束時姜黃素釋放率：胃4.4%、腸22.6%），OSA、葉酸修飾菊粉基膠束均能有效抑制姜黃素在模擬胃腸液中的釋放（消化結束時姜黃素釋放率：胃1.5%～2.5%、腸7.8%～18.6%），且釋放率順序為：OS-菊粉＞FA-菊粉＞FA-OS-菊粉。研究表明，載藥兩親性膠束由于疏水內核與藥物分子之間的疏水相互作用可呈現藥物的持續釋放，這種釋放是從親水外殼開始逐步向疏水內核進行的，介質進入內核溶解藥物，繼而腐蝕和降解膠束載體材料[8,31]。當膠束外殼表面被葉酸基團覆蓋時，介質較難靠近膠束內部，所以葉酸修飾明顯降低了姜黃素在胃腸液中的釋放率，這與Lü Yin等[25]的報道相似。表明FA-OS-菊粉膠束具有潛在的結腸靶向作用。

圖5 模擬胃液對荷載姜黃素菊粉基膠束粒徑（A）、PDI（B）和姜黃素保留率（C）、釋放率（D）的影響Fig.5 Effects of simulated gastric fluid on the particle size (A), PDI (B),curcumin retention (C), and curcumin release (D) of inulin-based micelles loaded with curcumin

圖6 模擬腸液對荷載姜黃素菊粉基膠束粒徑（A）、PDI（B）和姜黃素保留率（C）、釋放率（D）的影響Fig.6 Effects of simulated intestinal fluid on the particle size (A), PDI (B),curcumin retention (C) and curcumin release (D) of inulin-based micelles loaded with curcumin

3 結 論

本研究利用OSA和葉酸對菊粉進行修飾，研究發現，FA-OS-菊粉自聚集形成粒徑均勻的膠束，能顯著增強姜黃素荷載能力、熱穩定性和貯藏穩定性，FAOS-菊粉膠束在模擬胃腸液中荷載姜黃素的釋放較緩慢。因此，本研究表明，FA-OS-菊粉膠束能有效抑制姜黃素在模擬胃、腸液中的提前釋放，具有潛在的結腸靶向效果。FA-OS-菊粉膠束在模擬結腸液中的釋放特性，有待進一步深入研究。