新疆烏爾禾地區鹽漬土壤耐鹽細菌多樣性與群落結構研究

王改萍， 阿依古麗·托乎提， 王 茹， 祝長青

(新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室 新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣地特點和樣品采集 采樣地位于新疆省克拉瑪依市烏爾禾地區 (E87°43′5.0″，N46°23′56″)，屬北溫帶干旱氣候?？死斠朗惺切陆氖彤a地之一，其湖泊水域面積占克拉瑪依總面積的1%～2%。本實驗室在克拉瑪依市烏爾禾地區福?？h發現一無名湖，該湖周圍植被類別數量少，晝夜溫差較大，土壤被風化侵蝕較嚴重，荒漠發育。土壤主要以灰棕漠土、石膏灰棕漠土等為主，偏弱堿性(pH 7.29～7.86)[16]。2018年10月至2019年4月，在新疆烏爾禾自然湖鹽漬地區境內，以自然湖為中心，向湖邊緣規則性每隔200 m選取采樣地(表1)。每個采樣地采用五點取樣法采集土壤樣品，采樣時，去除地表石塊等雜物，采集深0～10 cm土壤，并將采集的樣品均勻混合作為一個土壤樣本，共采集5個土壤樣本。將采集的樣品帶回實驗室，自然烘干后過2 mm土壤篩，-80 ℃冰箱保存待用，分別用于土壤微生物多樣性分析和土壤理化性質分析。

表1 土壤取樣經緯度

1.1.2 培養基(g/L) ①LB培養基：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，蒸餾水1 000 mL，瓊脂16，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌 20 min；②牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，蒸餾水1 000 mL，瓊脂16，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌 20 min；③R2A培養基：酸水解酪蛋白 0.5，蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，酵母浸粉0.5，淀粉0.5，丙酮酸鈉0.3，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.3，瓊脂16， 蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌15 min；④高氏一號培養基：可溶性淀粉20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，瓊脂 20，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，121 ℃高壓滅菌15 min；⑤阿須貝無氮培養基：葡萄糖 10，NaCl 0.2，KH2PO40.4，CaSO4·2H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCO35.0，瓊脂16，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃高壓滅菌15 min[18]。

1.1.3 儀器與設備 全自動定氮儀(1035，福斯)；紫外分光光度計(CARY60，安捷倫)；原子吸收光譜儀(S系列，賽默飛)；pH計(FiveEasy Plus，梅特勒-托利多)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化 稱取土壤樣品5 g加入含有45 mL無菌水的錐型瓶中，37 ℃、200 r/min振蕩20 min。靜置取上清液做10倍梯度稀釋(10-3、10-4、10-5)，分別涂布于改良版篩選培養基平板(LB培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、R2A培養基、阿須貝無氮培養基、高氏一號培養基)，培養基中依次加入10、40、70、100 g/L 的NaCl，不同濃度3個平行重復，37 ℃培養48 h。計算不同鹽濃度平板上菌落數。選取含10 g/L NaCl的不同培養基平板上生長特征不同的菌株進行純化和斜面保種。

1.2.2 土壤理化性質測定 使用干渣法測定土壤水溶性鹽分，使用pH計測定土壤pH 值(V水∶V土=5∶1)、采用重鉻酸鉀容量外加熱法測定土壤有機質含量，采用高氯酸-硫酸消化法測定土壤全氮，采用酸溶-鉬銻抗比色法測定土壤全磷，采用酸溶-原子吸收法測定土壤全鉀含量。具體方法參照《土壤農化分析》[17]。

1.2.3 基于16S rRNA系統發育分析 將獲得的單菌落進行富集培養提取總DNA。細菌總DNA經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行16S rRNA基因擴增，PCR反應體系25 μL，上下游引物各1 μL、引物為細菌16S rRNA通用：1492R/27F(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCATCACCC-3′)/

(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′)；DNA模板2 μL；PCR MIX 12.5 μL；無菌水補充至25 μL。獲得擴增片段經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶清晰明亮，測檢平臺由上海生工生物工程股份有限公司提供。通過NCBI基因庫網站完成序列比對。釆用Bioedit和 MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。

1.2.4 菌株耐鹽受性研究 對其分離純化菌株進行耐鹽特性試驗，在篩選培養基的基礎上添加50、100、150、200 g/L(NaCl)；同時接種耐鹽菌株，37 ℃培養48 h，觀察菌株生長狀況并記錄。每個濃度3個重復。

1.2.5 Illumina HiSeq2500測序 利用Illumina公司的Hiseq 2500平臺進行測序(北京百邁克生物科技有限公司提供),步驟如下：①土壤樣品總DNA提取后，選擇16S rRNA保守區序列，設計得到引物。②將測序接頭加在預先設計好的引物末端，以土壤樣品基因組DNA 為模板，進行PCR擴增，將擴增產物進一步純化、定量、均一化，形成測序文庫。③在Illumina HiSeq 2500上機測序之前，需要將建好的測序文庫進行質檢，合格后方可進行測序。

1.2.6 數據分析 ①使用Excel 2007對土壤理化性質原始數據進行初步整理后用SPSS25.0進行方差分析。②使用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。不同種代表序列相對應不同的OTU，差異性高于97%的不同序列，認為不是同一個OTU，反之則相反。為了驗證測序數據量能否反映土壤樣品中細菌物種多樣性，從測序總樣本中按照一定數量無規則抽取序列，被抽取序列所代表的物種數目與序列數目構建曲線，通過曲線可以間接反映樣品中細菌物種的豐富程度。在一定范圍內，當曲線趨于平緩，則表示取樣數量合理。③將優化序列進行OTU聚類，根據劃分不同OTU的序列組成得到其相應物種分類?；贠TU分析結果，對土壤樣品在不同分類水平上(門、目、屬)繪制細菌群落分布餅狀圖，進行分類學分析。初步探究烏爾禾地區鹽漬土壤微生物多樣性。④采用生態學軟件Canoco 5.0對細菌優勢菌群與環境因子進行相關性分析，探討土壤鹽漬化對土壤細菌群落結構及豐富度的影響。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品理化性質分析

圖1 各鹽分離子占總鹽量百分比Fig.1 Percentage of eight ions in total salt content

表2 土壤理化性質

2.2 鹽漬土壤可培養耐鹽細菌多樣性

檢測到土壤樣品鹽分主要以氯化物為主，在篩選土壤耐鹽菌株中，鹽分主要選用NaCl。在土壤樣品10-4的稀釋濃度下，統計不同篩選培養基中細菌菌落數(圖2)，在含10 g/L的NaCl條件下長勢較好，而在100 g/L NaCl條件下，仍有部分菌株生長，屬于中度嗜鹽菌株，選擇含100 g/L NaCl的培養皿，挑選長勢較好的細菌進行純化培養，共獲得11株中度耐鹽菌株，對其16S rRNA基因進行測序分析。

圖2 NaCl鹽梯度土壤可培養細菌菌落數Fig.2 Numbers of culturable bacterial colonies in NaCl salt gradient soil

以提取11株菌株DNA為模板，擴增菌株16S rRNA基因序列，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示，獲得的1.5 kb的目的片段，條帶清晰明亮，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

圖3 菌株16S rRNA基因序列擴增結果Fig.3 The PCR result of 16S rRNA

基于可培養耐鹽細菌16S rRNA基因序列構建進化樹(圖4)，烏爾禾地區鹽堿土壤可培養耐鹽細菌(150 g/L)隸屬于5個屬的11個種，其中芽胞桿菌屬(Bacillus)、沉積物芽胞桿菌(Sediminibacillu)、鏈霉菌(Streptomyces)、海洋桿菌屬(Oceanbacillus)和甲基桿菌屬(Methylobacterium)分別占所測菌株數的45.46%、18.18%、18.18%、9.09%和9.09%。采用傳統培養法，分離得到鹽漬土壤少數耐鹽細菌物種，其中芽胞桿菌為絕對優勢類群。5株耐鹽菌株 16S rRNA 部分基因序列在屬分類學水平鑒定為芽胞桿菌，同源性98.79%～98.30%；2株耐鹽菌株16S rRNA 部分基因序列在屬分類學水平鑒定為沉積物芽胞桿菌；2株耐鹽菌株16S rRNA 部分基因序列在屬分類學水平鑒定為鏈霉菌屬；1株耐鹽菌株16S rRNA 部分基因序列在屬分類學水平鑒定為甲基桿菌屬；同源性99.49%。菌株B-6的16S rRNA 基因序列與相似模式菌株的同源性低于97%，新種的可能性較大[19]。菌株B-1與中國莎車縣鹽堿土壤中分離得到的OceanobacillusdamuensisPT-20T(HQ620704)同源性為 98.42%，屬于中度嗜鹽菌株[20]。菌株B-6和中國Nanhuobuxun鹽湖中分離獲得的SediminibacillusalbusNHBX5T(DQ989634)菌株[21]16S rRNA基因序列同源性為96.42%。要確定此菌株的確切分類地位，還需進行多項分類對其進行鑒定，以確定是否為新種。

圖4 基于土壤可培養耐鹽細菌16S rRNA基因序列構建進化樹Fig.4 Construction of phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of soil culturable

基于選擇性篩選培養基，對其分離菌株進行耐鹽特性初步試驗(表3)，菌株W-1在鹽質量濃度50 g/L的培養基中生長，卻在100 g/L鹽質量濃度下不能生長。其余10株菌株均能在鹽質量濃度100 g/L的培養基中生長，在鹽質量濃度為150 g/L的培養基中有部分分離菌株不能生長，表明所分離耐鹽菌株均為中度耐鹽菌株。

表3 菌株耐鹽特性

2.3 高通量測序結果分析

2.3.1 數據預處理 對土壤樣品進行高通量測序共得到303 367條序列，經過拼接和過濾處理后獲得290 952 條優化序列，序列長度420～423 bp。根據97%相似水平，將序列劃分為不同OTU，共獲得861個細菌OTU。物種數量與細菌測序數量進行Rarefaction曲線分析(圖5)，在相似度為97%，測序數量為35 750條時，隨著物種數量的緩慢增加，曲線漸趨于平緩，測序數量充分，數據合理。

圖5 土壤細菌序列數與物種數之間的Rarefaction曲線Fig.5 Rarefaction curve between species and sequences of bacteria from soil

2.3.2 細菌群落結構分析 新疆烏爾禾地區鹽堿土壤共有445個細菌物種，分屬于24個門、126個目、410個屬，在測得的24個門中，相對豐度為2%的有6個門，分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和藍細菌門(Cyanobacteria)，共占總相對豐度的97.7%；其中變形菌門為優勢菌門占總物種的60.3%，其次厚壁菌門占總物種的21.5%，而擬桿菌門和放線菌門分別占總物種的6.9%、6.0%(圖6A)。在目水平上，共測得126個目，相對豐度為2%的有8個，分別為腸桿菌目(Enterobacteriales)、梭菌目(Clostridiale)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、芽胞桿菌目(Bacillales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)、伯克氏菌目(Selenomonadales)、 擬桿菌目(Bacteroidales)和β-變形菌目(β-etaproteobacteriales)，其中腸桿菌目占總物種的44%，梭菌目占總物種的13%(圖6B)。在屬水平上，共測得410個屬，其中相對豐度在2%的有8個，分別為克呂沃爾菌(Kluyvera)、Hafnia-Obesumbacterium、假單胞菌屬(Pseudomonas)、[Ruminococcus]_torques_group、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、巨單胞菌屬(Megamonas)、Rummeliibacillus和擬桿菌屬(Bacteroides)，共占相對豐度的66.5%。其中克呂沃爾菌屬與Hafnia-Obesumbacterium為優勢菌屬，分別占總物種的21.0%和19.6%；假單胞菌屬占7.5%、[Ruminococcus]_torques_group占3.7%、金黃桿菌屬占3.5%，巨單胞菌屬占3.3%，Rummeliibacillus占2.7%，擬桿菌屬占2%(圖6C)。

圖6 鹽漬土壤細菌優勢物種分布Fig.6 Distribution of bacterial species A：門水平餅狀圖；B：目水平餅狀圖；C：屬水平餅狀圖A：Phylum level piechart； B：Order level piechart；C：Genus level piechart

借助高通量測序技術，發現新疆烏爾禾地區鹽堿土壤細菌種類多樣， 細菌群落結構較為復雜。變形菌門和厚壁菌門是新疆烏爾禾地區鹽堿土壤的優勢菌門；腸桿菌目(Enterobacteriales)與梭菌目(Clostridiale) 是新疆烏爾禾地區鹽堿土壤的優勢菌目；克呂沃爾菌屬與Hafnia-Obesumbacterium為新疆烏爾禾地區鹽堿土壤的優勢菌屬[21]。

RDA排序圖用來表示環境因子對于樣本中微生物群落組成的影響(圖7)，梭狀芽胞桿菌綱(Clostridia)與擬桿菌綱(Bacteroidia)分布差異較小，桿菌綱(Bacilli)與γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)分布差異較小，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)分布差異較小。土壤總鉀(TK)含量對Gemmatimonadetes、Alphaproteobacteria的影響較大。土壤pH對Clostridia、Bacteroidia的影響較大。而土壤有機質(Toc)、土壤可溶性總鹽(Salt)、土壤總磷(TP)、土壤總氮(TN)的含量對厭氧菌綱(Negativicutes)、放線菌綱(Actinobacteria)、桿菌綱(Bacilli)、γ-變形菌綱的影響較大。土壤總鉀(TK)含量對Alphaproteobacteria、Gemmatimonadetes的影響較大。其中鹽漬土壤可溶性總鹽(Salt)是鹽漬土壤中所含的大量水溶性鹽在一定時間按照V土∶V水=1∶5提取出的總可溶性鹽量[22]。烏爾禾地區鹽漬土壤可溶性含鹽量高達239.675 g/kg，對其優勢微生物菌群多樣性產生影響。

圖7 鹽漬土壤環境因子與細菌優勢物種的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis of environmental factor and dominant bacterial species in the same soil

3 討 論

含鹽(NaCl)量高于0.2%(質量分數)的土壤被稱為鹽漬土壤，這種特殊環境中，仍然有多種耐鹽微生物能夠生存[23]。新疆荒地土壤中鹽堿土壤面積高達7 330萬hm2，其中輕度和中度鹽堿化土壤面積占26.6%[24]。因此，新疆鹽堿土壤特殊細菌資源研究較為廣泛。在研究土壤生態系統微生物多樣性中，許多微生物不適宜在實驗室采用傳統方法如平板培養法進行培養，因此細菌多樣性結果不全面。利用高通量測序技術可以獲得不同程度鹽堿土壤中相關細菌較豐富的種群多樣性、遺傳多樣性和生態多樣性[25]。

土壤樣品鹽分的測定結果表明，烏爾禾地區鹽漬土壤鹽分集中分布于地表(0～5 cm)，含量高達239.675 g/kg。相關研究表明土壤微生物對其生活環境鹽分變化十分敏感，隨著土壤鹽分含量遞增，土壤微生物數量呈現減少趨勢，土壤全鹽分含量與土壤微生物數量呈現負相關。由于鹽分含量較高導致土壤微生物滲透脅迫，從而使土壤微生物多樣性降低[26]。研究發現土壤鹽堿化程度越高，土壤有機質與全磷含量越低，且土壤細菌群落的多樣性和豐度也越低[27]。對新疆烏爾禾地區鹽漬土壤環境因子與綱水平細菌優勢菌群進行冗余分析發現，可溶性鹽分(Salt)、有機質(Toc)、總氮(TN)、總磷(TP)這些土壤因子相關性較密切，且對土壤樣品細菌群落結構影響較大，而pH對土壤樣品細菌群落結構影響相對較小，推測土壤樣品呈現微弱堿性，絕大多數細菌均能適應該地區土壤的微弱堿性，因此該地區土壤細菌多樣性受pH影響較小。

采取傳統的分離培養法對土壤進行耐鹽細菌多樣性分析發現，新疆烏爾禾地區鹽堿土壤可培養耐鹽細菌以芽胞桿菌屬為絕對優勢類群。芽胞桿菌隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)。馮偉等[28]對天津團泊湖地區鹽堿土壤中可培養耐鹽堿菌進行了歸屬分析，認為優勢細菌種群為芽胞桿菌屬和海洋芽胞桿菌屬。已有研究報道，芽胞桿菌可以產生內生孢子并能在干燥、高溫、紫外輻射等不利環境下維持自身能力不受傷害[29]。在新疆烏爾禾地區鹽漬土壤極端環境中，芽胞桿菌屬較其他細菌適應性更強，成為土壤樣品中可培養耐鹽細菌的優勢菌群。分離到的耐鹽菌株B-6與菌株SediminibacillusalbusNHBX5T(DQ989634)相似性低于97%，菌株NHBX5T最適生長鹽濃度為70 g/L，為中度嗜鹽菌株，雖然菌株B-6也是中度耐鹽菌株[21]，但是否是潛在的新種，還需進一步研究。

基于高通量測序技術對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行擴增與測序分析發現，新疆烏爾禾地區鹽漬土壤的細菌優勢菌群較為單一，包括變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門細菌。俞冰倩[30]對我國不同區域的鹽堿土壤微生物多樣性研究發現，變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和藍細菌門為優勢類群。變形菌門和厚壁菌門是許多鹽漬化土壤中的優勢菌群[31]。研究證明松嫩平原鹽堿地可培養微生物類群同樣以隸屬于厚壁菌門的細菌為主要優勢類群[32]。代金霞等[33]對銀北鹽漬化土壤中6種耐鹽植物根際細菌多樣性研究發現，雖然不同的耐鹽植物根際微生物群落豐度存在差異，但是微生物群落組成相似，均以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門為主要優勢類群。在印度庫奇小沼澤的鹽堿沙漠可培養微生物中，厚壁菌門是優勢菌門[34]。與上述研究結果相比，本研究鹽漬土壤優勢菌群厚壁菌門、變形菌門在上述鹽漬土壤中皆有分布，均為鹽漬土壤的優勢菌群。

傳統分離法和高通量測序技術的分析結果表明，變形菌門與厚壁菌門為優勢菌群。在屬分類水平上，由于本實驗采取傳統分離培養法，不能充分揭示可培養耐鹽細菌的多樣性，而高通量測序技術不僅能充分揭示可培養細菌的多樣性，還能充分揭示不可培養細菌的類群多樣性。在研究微生物群落結構的過程中，高通量測序技術發揮著傳統分析方法無可替代的作用， 在一定程度上促進了人們對環境微生物生態學的認識[35]。本研究采用傳統培養法分離篩選新疆烏爾禾地區耐鹽細菌，同時對其進行耐鹽特性研究，并借助高通量測序技術分析土壤樣品耐鹽細菌多樣性，為新疆烏爾禾地區耐鹽細菌多樣性以及特色功能菌株的篩選提供參考。

從新疆北部烏爾禾地區鹽漬土壤中分離獲得11株可培養中度耐鹽菌株，通過16S rRNA基因序列分析11株菌株分屬于5個屬，菌株對NaCl 濃度表現出良好的適應性。鹽漬土壤因子Toc、Salt、TN、TP與微生物多樣性相關性密切，其中Salt因素對鹽漬土壤細菌群落結構與多樣性相關性較大。鹽漬土壤中厚壁菌門(60.3%)、變形菌門(21.5%)為優勢菌門，群落結構較為復雜。