急性胰腺炎大鼠caspase-1依賴性腺泡細胞焦亡的觀察

邱婷，占凌輝，陸程翔

廈門大學附屬中山醫院神經內科1、重癥醫學科2，福建 廈門 361004

細胞焦亡是一種新近研究發現的細胞死亡方式。它以伴隨著大量炎癥因子的釋放為特征，能夠誘發強烈的炎癥反應。在多種炎癥性疾病中已顯示出與炎癥反應的持續加重及不良預后有關[1-3]。既往認為，在急性胰腺炎中通常存在大量的細胞凋亡現象。近年來的研究顯示，這些被檢測出的凋亡細胞事實上有相當一部分其實是焦亡的細胞[4]。但是細胞焦亡在急性胰腺炎中的具體情況目前仍不清楚。本研究旨在探討caspase-1依賴性腺泡細胞焦亡在急性胰腺炎中的具體情況，為臨床治療急性胰腺炎提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 動物選擇與分組 健康成年Wistar大鼠12只，體質量160～180 g。采用隨機數表法將其分為對照組和胰腺炎組，每組6只。

1.2 模型制備及處理 實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。胰腺炎組大鼠分2次腹腔內注射20%L-精氨酸溶液(2×100 mg/100 g)，間隔1 h。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水(1.0 mL×2)。

1.3 光鏡蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察胰腺組織病理學變化 造模成功后24 h，兩組大鼠采血后處死，經腹腔分離切取胰腺組織塊，常規石蠟包埋。將石蠟包埋的胰腺組織切片，行HE染色，在光鏡下觀察胰腺組織學改變。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測腺泡細胞caspase-1、GSDMD表達情況 胰腺組織塊以裂解液進行裂解。用BCA法測定蛋白質含量。之后稀釋樣本至2μg/μL。取40μg樣品行SDS-PAGE電泳。用濕轉法將凝膠上蛋白樣品轉印到PVDF膜上并加入兔一抗封閉過夜(GSDMD：Abcam公司；caspase-1：碧云天)。次日5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，羊抗兔ΙgG(H+L)HRP(GSDMD：abcam公司；caspase-1：碧云天)反應。實驗中以β-actin(Abcam公司)作為內參照。繼以ECL反應后顯影、定影。用Quantity One軟件進行定量測定(v4.62版本)。結果以待測蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 血清標本采集與處理 各組于模型制作成功后24 h經尾靜脈采集靜脈血，室溫下，離心并取上清液于-70℃保存。以ELΙSA測定血清白介素-1β(ΙL-1β)、白介素-18(ΙL-18)水平。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0軟件分析數據。所有計量資料以均數±標準差(±s)表示，均數間比較采用t檢驗，相關分析采用Person相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠胰腺組織的病理學改變 胰腺炎組大鼠的胰腺肉眼大體觀可見：胰腺組織明顯水腫，顏色暗紅，未見到明顯的出血及壞死表現。鏡下病理變化較輕微，主要是以間質水腫、空泡形成以及炎性浸潤為主。對照組則無明顯病理改變，見圖1。

圖1 胰腺組織的病理學改變(×200)

2.2 兩組大鼠腺泡細胞活化caspase-1、GSDMD表達水平比較 與對照組比較，胰腺炎組的活化caspase-1及GSDMD表達水平明顯增高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

組別對照組胰腺炎組t值P值例數6 6 caspase-1 0.20±0.02 0.59±0.04 19.221＜0.05 GSDMD 0.23±0.02 0.58±0.08 9.947＜0.05

2.3 兩組大鼠的血清ΙL-1β、ΙL-18水平比較 胰腺炎組大鼠血清ΙL-1β和ΙL-18明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠血清IL-1β、IL-18比較(±s，pg/mL)

表2 兩組大鼠血清IL-1β、IL-18比較(±s，pg/mL)

組別對照組胰腺炎組t值P值例數6 6 ΙL-1β 24.34±4.52 115.14±13.12 16.028＜0.05 ΙL-18 21.67±3.98 185.91±14.72 26.375＜0.05

2.4 caspase-1與血清ΙL-1β、ΙL-18水平的相關性 應用Pearson相關分析法檢驗胰腺組織活化caspase-1與血清ΙL-1β、ΙL-18水平的相關性，結果顯示，胰腺組織活化caspase-1與血清ΙL-1β、ΙL-18水平均有顯著的正相關性(相關系數分別為0.979和0.974，P＜0.01)。

3 討論

急性胰腺炎作為一種常見的急重癥，其病情兇險多變，它的發生發展及轉歸一直是臨床醫學研究的重點之一。急性胰腺炎發病機制上，通過胰酶的激活、大量的細胞因子和氧自由的產生造成腺泡細胞的損傷,這些受到損傷的腺泡細胞進一步在多種炎癥介質的作用下發生胞膜破裂以及更多的炎癥因子釋放，最終形成放大式的炎癥反應加重。通常胰腺腺泡細胞的損傷可以出現凋亡、自噬、焦亡和壞死等多種死亡結局。細胞焦亡是較新發現的一種受調控的程序性的細胞死亡方式[5]。細胞焦亡發生時，有較多的微小孔隙在細胞膜上形成并導致細胞膜的受損,進而使得細胞膜兩側的離子梯度消失，炎性物質從胞內釋放到胞外，細胞間液流入胞內，最終細胞出現腫脹破裂。與這一過程同時發生的還有細胞核的濃縮以及隨機降解和斷裂的染色體DNA。與凋亡的不同之處在于焦亡細胞雖然也有發生核固縮，但其細胞核能夠保持完整，而不發生核裂解[6-7]。

隨著對焦亡的研究深入，已有諸多線索提示腺泡細胞焦亡在急性胰腺炎中可能發揮重要的作用。比如，通過新的檢測手段能區分出在急性胰腺炎中用TUNEL法檢測出來的凋亡細胞中是混有雜有許多焦亡細胞的；在胰腺炎的標本中明確檢測出活化caspase-1陽性表達；在caspase-1基因缺乏大鼠制作的急性胰腺炎中觀察到明顯的降低的炎癥的程度[8-9]；在用雨蛙素腹腔注射制作的大鼠急性胰腺炎模型中觀察到ΙL-1β前體的mRNA水平出現明顯的增高[10]；急性胰腺炎患者血清中ΙL-1水平也明顯高于正常人群[11-12]。研究普遍認為凋亡減輕炎癥反應而焦亡促進炎癥反應,對疾病的轉歸影響截然不同。但是，目前對于細胞焦亡在急性胰腺炎中的具體情況尚不明確。

新近的研究結果表明焦亡所依賴的caspase-1在急性胰腺炎炎癥反應過程中發揮的作用不容忽視。焦亡過程中ΙL-1β前體需要在caspase-1的作用下方能轉化為有活性的ΙL-1β進而釋放至胞外發揮作用。誘導caspase-1基因表達或者caspase-1基因缺乏均可以影響急性胰腺炎大鼠的炎癥程度[8-9]。近年來對于GSDMD的深入研究認為Pro-caspase-1有切割GSDMD的作用。Caspase-1前體在被激活之后能夠對GSDMD進行切割，終致啟動細胞焦亡[13-14]。GSDMD作為caspase-1的作用底物，在被其切割后形成的氮端肽段是發生細胞焦亡的關鍵步驟。敲除GSDMD基因能夠使細胞焦亡受到阻斷，細胞最終發生凋亡?；贕SDMD在焦亡中的這一重要地位，目前普遍認為，能否驗證GSDMD的活化是證實細胞發生焦亡的重要依據之一。在本研究中，活化caspase-1指標明顯增高，并且GSGDM也出現明顯增高，這些結果反映了在急性胰腺炎中存在明顯的caspase-1依賴性細胞焦亡現象。并且這種焦亡形式在急性胰腺炎的炎癥發展中起著某種重要的作用。

目前已知，經典焦亡途徑是caspase-1介導的需炎癥小體參與的通路。各種損傷信號經過傳導而作用于炎性小體，使得caspase-1活化，終致細胞膜上形成孔洞，同時ΙL-1β和ΙL-18前體也被活化并釋放出細胞，能夠造成炎性細胞的黏附、聚集，放大組織炎癥反應，這是細胞焦亡發生的主要機制[15-16]。其具體的過程，目前認為是炎性小體通過其所包含的接頭蛋白ASC以CARD-CARD和PYD-PYD相互作用結合的形式，把caspase-1和炎性小體以類似橋梁的形式銜接在一起，這樣caspase-1前體被活化，并且可以作用于ΙL-1β和ΙL-18前體使其得以激活[17-18]。這樣在細胞焦亡的同時，出現了瀑布式的炎癥反應。已有學者的研究證實，在急性胰腺炎早期階段ΙL-1β及ΙL-18就出現明顯的升高，并且在整個病情進展過程中始終保持著較高的水平[19]。在研究中，可以發現血清ΙL-β和ΙL-18表達出現顯著增高，并且相關性證實caspase-1的活化與血清ΙL-β和ΙL-18的增高之間呈顯著正相關性。這更增加了caspase-1依賴性細胞焦亡存在的證據。因此，也有理由相信，綜合caspase-1、GSDMD和ΙL-1β和ΙL-18的顯著活化情況可能是反映腺泡細胞焦亡程度的一個預測指標，對于判斷急性胰腺炎的預后有重要的意義。

本研究未就細胞焦亡的病理表現進行深入的研究，其與caspase-1依賴的GSDMD活化的相關性尚不清楚。這一途徑是否還存在其他形式的激活通路，能否通過抑制這一焦亡途徑來實現抑制胰腺炎的發生及發展？這些還需要進一步的研究探討。