FcRn對新型抗西尼羅河病毒單抗MIL94體內藥代動力學的影響

相亞楠，王靈超，高 尤，張文鵬，莊笑梅

(1.天津大學化工學院，天津 300072；2.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，北京 100850)

西尼羅熱是由西尼羅河病毒引起的一種人畜共患性傳染病，自1999年起首次在北美洲大面積流行[1]。目前無批準上市的疫苗及藥物用于西尼羅河熱的預防和治療。雖然我國尚無該病的病例報告，但作為潛在的傳染性疾病，亟需開發儲備藥物。MIL94是由軍事醫學研究院研究的全人源單克隆抗體，前期小鼠染毒試驗結果顯示能夠全保護病毒感染(數據未公開)，正在進行系統的臨床前藥代動力學研究。

單抗藥物(mAB)與傳統的小分子藥物相比，具有完全不同的理化特性，其分子質量、體積和極性都遠遠大于小分子。這些特性使得單抗藥物在體內吸收、分布和消除等過程與小分子藥物不同[2]。單抗的消除途徑主要有3種：1)蛋白酶水解。單抗藥物因相對分子質量較大不會經腎臟直接濾過，可在蛋白酶的作用下降解為肽段，被機體重新利用。這種水解是非特異性的，在單抗藥物的消除中貢獻率也比較低。2)免疫系統清除。機體的可溶性抗原與單抗結合形成免疫復合物，繼而被免疫系統清除。同時單抗藥物可能在體內引起免疫反應而產生抗藥物抗體，單抗藥物與之結合后隨即被免疫系統清除。3)溶酶體水解。單抗藥物可以與細胞表面膜結合型抗原結合或與細胞表面Fcγ(可結合IgG)受體結合后內吞至細胞內，也可以非特異性吞飲的方式進入細胞，然后被細胞內的溶酶體降解成肽段和氨基酸[3]。

新生兒受體(FcRn)是影響抗體半衰期的主要原因[4]。FcRn是由大小兩個亞基組成的異源二聚體，大亞基分子量為45-53 ku，稱為α鏈；小亞基是β 2微球蛋白(β2m)，分子量為14 ku，稱為β鏈，兩條鏈以非共價鍵的形式結合在一起。β 2微球蛋白對于FcRn功能有重要的作用，α鏈必須和β 2微球蛋白裝配后才能發揮轉運作用。α鏈與MHC I類分子一樣，具有α1、α2和α3 3個胞外功能區、1個跨膜區和1個胞質尾區。由44個氨基酸殘基組成的胞質尾區，可能含有介導胞內途徑的信號[5]。FcRn與抗體或蛋白的結合具有pH依賴性，在生理pH為7.4時，FcRn不與IgG結合，但是在內涵體酸性(pH 6.0-6.5)的條件下，FcRn與核內體中IgG的Fc結構域結合，保護IgG不被降解，從而延長了IgG的血清半衰期。FcRn延長內源性IgG和白蛋白的循環半衰期的作用已經在體內外研究中廣泛證實，在FcRn敲除小鼠體內內源性IgG和白蛋白的半衰期明顯縮短[6-7]。IgG的Fc片段與FcRn受體結合起關鍵性作用，并且在Fc上特異性變異可以明顯提高與FcRn的親和力[8]，為單抗藥物設計開發提供了優化方向。

本文擬在表達不同種屬FcRn的小鼠體內進行MIL94的藥代動力學研究，觀察比較FcRn與MIL94體內消除和分布的關系，預期該抗體在人體內的藥代特征。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器酶標儀(德國BMG LABTECH公司)；微量加樣器(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(美國Thermo公司)；微量振蕩器(廣州SCILOGEX公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；小動物呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；洗板機(北京天石天力醫療器械技術開發中心)；96孔板(美國Thermo公司)。

1.2 實驗藥品與試劑MIL94單克隆抗體(浙江海正藥業有限公司，批號：190401)；包膜蛋白(Envelope Protein，美國Sino Biological公司，批號：40345-V08Y)；羊抗人IgG-HRP(北京Solarbio公司，批號：SE101)，HRP為辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase)；TMB顯色液(四甲基聯苯胺，3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，美國Invitrogen公司，批號：00-4201-56)；包被液：碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖液(碳酸鈉、碳酸氫鈉均為國藥集團化學試劑有限公司)；PBS(美國Gibco公司，批號：C10010500BT)；洗滌液：PBST溶液(含0.05% Tween 20的PBS，Tween 20為國藥集團化學試劑有限公司，批號：120216)；酪蛋白封閉液(美國SIGMA公司，批號：C5890)；促凝采血管(美國BD公司，添加SST Amber高分子凝膠促凝，批號：9136623)；靜脈注射用人免疫球蛋白(IVIG，Intravenous immunoglobulin，河北大安制藥有限公司，批號：B20200201)；1 mL注射器(美國BD公司，批號：5232454)。

1.3 實驗動物雄性C57野生小鼠10只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。雄性hFcRn小鼠(只表達人FcRn不表達小鼠FcRn的轉基因小鼠)20只，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2019-0002。雄性FcRn基因敲除小鼠(不表達FcRn基因的小鼠)5只，購自北京澄天生物科技有限公司，使用許可證號：SYXK(京)2018-0016。所有小鼠體質量均為(20-25)g。小鼠購入后飼養于軍事醫學研究院動物房，室溫維持在(26 ± 2)℃，相對濕度(55 ± 5)%，12 h/12 h 光照/避光循環，實驗期間動物自由取食、飲水，小鼠接受的所有操作均符合本單位實驗動物倫理委員會規定(倫理號：IACUC-DWZX-2020-627)。

1.4 間接ELISA法測定小鼠血清MIL94濃度用包被緩沖液將抗原稀釋到1 mg·L-1，96孔酶聯板中每孔加入100 μL，4℃包被過夜。每孔加入200 μL封閉液，37 ℃孵育1 h。用空白混合小鼠血清稀釋系列濃度(0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1)的MIL94制備成標準曲線樣品，0.031 25、16 mg·L-1作為錨定點不參與定量，同法配制0.125、0.8、6.4 mg·L-1的MIL94質控樣品，每孔加入100 μL，設置復孔，37 ℃孵育2 h。用二抗稀釋液按1 ∶50 000稀釋HRP標記的羊抗人IgG，每孔加入100 μL，37 ℃避光孵育1 h。加入TMB顯色液，室溫避光放置10 min。最后加入1 mol·L-1的 H2SO4終止液終止反應，用酶標儀于450 nm波長處測定OD值。將標準曲線樣品濃度值(X)與所測定的吸光值(Y)利用 SPECTRO starNano軟件的四參數法進行擬合。擬合方程為：Y = Bottom +(Top-Bottom)/(1+(EC50/X)^Slope)。其中Top為擬合曲線的上端漸進線的估計值(OD值)，Bottom為擬合曲線的下端漸進線的估計值(OD 值)，Slope為校正曲線的斜率，X為實測濃度，EC50為50%光吸收值所對應的樣品濃度值，通過擬合最優的曲線作為校正曲線。

按照生物樣品指導原則的要求，用該ELISA法對特異性、精密度、準確度、選擇性、稀釋線性、鉤狀效應、平行性和穩定性等進行全面驗證。

1.5 實驗設計

1.5.1給藥方案 野生型小鼠(WT-C57)隨機分成2組，每組5只，分別為靜脈注射5 mg·kg-1和50 mg·kg-1的MIL94。于給藥前及開始后10 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、72 h、120 h、144 h靜脈采血。hFcRn小鼠隨機分成4組，每組5只，分別為靜脈注射5 mg·kg-1的MIL94、靜脈注射50 mg·kg-1的MIL94、腹腔注射IVIG(1 g·kg-1)2 h后+靜脈注射MIL94(5 mg·kg-1)、腹腔注射IVIG(1 g·kg-1)2 h后+靜脈注射MIL94(50 mg·kg-1)。FcRn基因敲除小鼠5只，靜脈注射MIL94(50 mg·kg-1)。hFcRn小鼠(無IVIG組)、FcRn基因敲除小鼠(FcRn-/-)采血點均為給藥前及開始后10 min、1、2、4、8、12、24、48、72 h靜脈采血。hFcRn小鼠(含IVIG組)采血點為給藥開始后10 min、1、2、4、8、12、24、48、72、120、144 h。采血量約30 μL，置于促凝離心管中。

1.5.2血清樣品的制備 全部血樣均于室溫凝固30 min后，4℃，2 500×g轉速離心10 min獲得血清，分裝后于-40 ℃凍存，待測。

1.6 數據處理

1.6.1藥代動力學參數計算 應用WinNonlin軟件，按非房室統計矩模型計算靜脈注射給藥后小鼠的主要藥代動力學參數：曲線下面積(AUC)，清除率(CL)，穩態表觀分布容積(Vss)，消除半衰期(T1/2)和平均駐留時間(MRT)，采用 Microsoft EXCEL(2010)計算均值、標準差(s)，使用 GraphPad Prism 6 作圖。

2 結果

2.1 MIL94在小鼠血清中ELISA定量方法的建立與驗證MIL94在0.0625-8 mg·L-1范圍內，濃度的對數值與吸光值(OD 值)呈S形曲線，定量下限為0.062 5 mg·L-1。加入Human IgG對MIL94濃度測定無干擾(特異性滿足要求)。批內精密度波動在2.53%-7.69%。批間精密度波動在0.01%-8.33%之間。稀釋線性的準確度90.42%-100.32%之間，無明顯的鉤狀效應。選擇性、平行性滿足要求。樣品凍存至14 d穩定。該方法靈敏度好，1 μL樣品即可測定樣品濃度，提示該方法可用于小鼠血清中MIL94濃度的定量檢測。

2.2 靜注MIL94(5 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數靜注MIL94(5 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數見Fig 1及Tab 1。結果顯示，靜注MIL94(5 mg·kg-1)后野生型小鼠與人源化FcRn小鼠藥-時曲線很相似，但hFcRn小鼠合用IVIG后血藥濃度降低明顯加快(Fig 1)。人源化FcRn小鼠與野生型小鼠相比，平均半衰期增加到2.1倍[(5.19±3.63)d與(2.43±0.25)d]，T1/2、AUC、Vss、CL、MRT差異均有統計學意義，提示在低濃度下，不同種屬的FcRn對MIL94的半衰期有明顯影響。hFcRn小鼠合用IVIG后與hFcRn小鼠未合用IVIG組相比，體內暴露量AUC明顯減小，半衰期從5.19 d縮短至0.64 d，清除率從19.26提高至76.28 mL·d-1·kg-1，T1/2、AUC、Vss、CL、MRT差異均有統計學意義，提示hFcRn小鼠注射IVIG后，IVIG與體內的hFcRn發生結合，導致與MIL94結合的hFcRn減少，半衰期明顯縮短。

Fig 1 Serum concentration-time curves of MIL94(5 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice n=5)

2.3 靜注MIL94(50 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數靜注MIL94(50 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數見Fig 2及Tab 2。結果顯示，靜注MIL94(50 mg·kg-1)后，hFcRn小鼠與野生型小鼠相比血藥濃度降低略慢，而FcRn-/-小鼠和hFcRn小鼠合用IVIG后的藥-時曲線幾乎重合，藥物體內血藥濃度降低速度明顯加快(Fig 2)。與野生型小鼠相比，MIL94在hFcRn小鼠體內的清除率降低，暴露量增多，提示hFcRn可能影響MIL94清除進而影響暴露。hFcRn小鼠合用IVIG組與hFcRn小鼠未合用IVIG組相比血藥濃度降低，T1/2、Vss、CL差異有統計學意義(P<0.05)，提示IVIG通過影響FcRn與MIL94結合進而影響MIL94的分布和清除(Tab 2)。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of MIL94(5 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of MIL94(50 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice

Fig 2 Serum concentration-time curves of MIL94(50 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice n=5)

2.4 FcRn對MIL94體內消除和分布的影響將MIL94在不同組別小鼠體內的藥代動力學參數進行橫向比較，結果見Fig 3-5。結果顯示MIL94的消除半衰期與FcRn的種屬和功能密切相關。在不同品系小鼠相同劑量給藥后半衰期有統計學差異，表達hFcRn的小鼠體內半衰期約為野生型小鼠的2倍，而在敲除FcRn基因小鼠體內半衰期明顯縮短，與在hFcRn小鼠合用IVIG后的半衰期相當(0.5-0.6 d)。進一步將各組清除率數據進行橫向比較發現，其組間差異的趨勢與消除半衰期的關系相似。清除率在同種品系小鼠低劑量給藥后無明顯差別，高劑量給藥后明顯降低，總體趨勢為在hFcRn小鼠體內清除率略低于野生型小鼠，而在敲除FcRn基因小鼠體內的清除率明顯增加，并與在hFcRn的小鼠合用IVIG后的清除率相當(70 ～ 90 mL·d-1·kg-1)，是野生和hFcRn小鼠清除率的3 ～ 9倍。將各組穩態表觀分布容積(Vss)數據進行橫向比較發現，MIL94在各組小鼠的Vss都比較低，說明其組織分布較少。另外，在敲除FcRn基因小鼠體內其Vss與野生型小鼠相比降低2倍，在hFcRn的小鼠合用IVIG后Vss比合用前降低不到2倍，提示FcRn也在一定程度上影響MIL94的體內分布，進而影響暴露。通過上述比較研究發現，FcRn通過影響MIL94的體內消除和分布，改變其在不同種屬中的半衰期。

Fig 3 The T1/2 of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

Fig 4 CL of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

Fig 5 Vss of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

3 討論

隨著生物醫藥在全球范圍蓬勃發展，單抗藥物已逐漸成為新藥領域的重要組成。截止2020年4月底全球獲批上市的單抗藥品共計91個，并且近幾年單抗藥物上市明顯加速。隨著單抗藥物在臨床研究和應用的日益廣泛，針對這類藥物藥代動力學機制和特征的研究更凸顯其重要性。與小分子藥物相比，單抗藥物作用機制更加明確，其體內藥效與藥物暴露關系更加直接[9]，體內藥代動力學特征很大程度上決定其藥效發揮，因此評價和預測單抗藥物的藥代動力學特征至關重要。如果單抗藥物在體內有效暴露量能夠維持更長時間，可大大提高病人的順應性并降低給藥劑量，因此其體內半衰期是決定單抗藥物藥效的重要指標之一。大分子藥物體內半衰期受到給藥途徑、藥物體內分布及代謝清除等主要因素影響。MIL94是針對西尼羅河病毒設計的全新的人源化單抗藥物，通過靜脈注射入血中和病毒達到防治作用，目前在臨床前研究階段。MIL94體內半衰期的特征和機制研究將為其臨床開發提供重要依據。

MIL94的分子量72 ku，大于腎臟濾過的低限分子量(50-60 ku)，且難以透過生物膜，其表觀分布容積被細胞外的容積空間所限制[10]。由于其具有IgG結構特征，pH依賴的FcRn循環機制可能對其體內半衰期發揮重要作用。FcRn基因首次從大鼠細胞中分離出來，隨后，小鼠、人、牛、豬等的同源基因陸續被分離鑒定，通過基因序列比對發現具有高度同源性。FcRn在多種組織器官中均有表達，但是其表達模式有一定的種屬差異。鑒于FcRn對單抗藥物半衰期的影響，已建立了體內外模型評價FcRn與mAB的親和力，用于篩選和評價單抗藥物。其中表面等離子共振技術(SPR)作為成熟的評估生物分子間相互作用的工具，是最常用的體外模型[11]。大部分研究結果表明，單抗藥物與酸性條件下FcRn的結合作用與體內半衰期相關；但也有結果發現，與中性條件下與FcRn的解離作用更相關[12]；還有結果表明，一些單抗藥物的半衰期與體外獲得的FcRn親和力并不相關[13]。體內模型包括應用與人同源性最高的非人靈長類動物以及轉基因動物進行藥代動力學研究。由于猴的來源比較有限，基因工程小鼠模型是重要的研究工具，常用的包括表達hFcRn的小鼠和FcRn敲除小鼠。IVIG是注射用免疫球蛋白，可以與hFcRn結合。研究表明，小鼠注射大劑量的IVIG后由于飽和了體內FcRn，也可以間接敲除FcRn功能[14]，并且表達hFcRn的小鼠注射1 g·kg-1的IVIG后，無不良反應，并且可以明顯縮短單抗藥物半衰期[15]。大量研究證明，hFcRn轉基因動物體內的結果與猴及人體內的結果更加接近。因此在本研究中，首次同時應用野生型小鼠、FcRn敲除小鼠、表達hFcRn的小鼠以及表達hFcRn的小鼠合用IVIG后比較研究不同劑量MIL94的體內藥代動力學特征，證明FcRn的作用及種屬差異。MIL94作為一類新藥，本課題組前期已經開展了MIL94在大鼠、食蟹猴體內低、中、高3個劑量(0.5-50mg·kg-1)的藥代動力學實驗，結果均顯示線性清除(數據未公布)，推測MIL94在正常小鼠體內是線性清除。因此本研究中每組只設計了5-50 mg·kg-1兩個劑量研究FcRn介導的種屬差異。

結果表明，5-50 mg·kg-1劑量范圍的MIL94在野生型小鼠和hFcRn的小鼠體內的藥代動力學基本成線性過程。同時，各組動物體內的分布容積均略高于小鼠血漿容積(50 mL·kg-1)，說明其組織分布受限，但FcRn敲除小鼠的分布容積最小，提示FcRn也在一定程度上影響MIL94的分布。體內半衰期在不同組別之間有較大差異，提示FcRn參與MIL94的消除，并且有一定種屬差異。在表達hFcRn的小鼠體內的半衰期比野生型小鼠更長，可能由于MIL94是全人源化的單抗，與hFcRn的親和力比mFcRn的要強，但是由于FcRn與單抗的結合過程還受到很多因素的影響，具體機制尚需深入研究。

綜上，本研究在表達不同種屬FcRn的動物模型中研究了MIL94的藥代動力學特征，獲得了FcRn對MIL94體內分布和消除的影響，預測MIL94在人體內半衰期比動物長。靶點介導的消除(TMDD)是單抗藥物體內的特異清除途徑[16]，下一步將在病毒感染動物模型中開展MIL94的藥代動學研究，進一步預測MIL94在臨床患者體內的暴露特征。

(致謝：感謝佛羅里達大學生物統計博士Jack Yan在數據統計處理中給予的幫助。)