燈盞花素促進缺血/再灌注損傷的微血管內皮細胞自噬、抑制氧化損傷及凋亡

王娓娓，葉 宏，孫 林，鮑天昊，3

(1.昆明醫科大學第二附屬醫院心內科，云南 昆明 650101；2.昆明醫科大學病理教研室，云南 昆明 650101；3.云南省精神病醫院老年科，云南 昆明 650101)

心肌梗死后快速恢復梗死區域供血、供氧會進一步誘發心血管損傷，這種恢復血液供應而導致的組織損傷加重現象稱心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIR)[1]。在缺血/再灌注(ischemia/reperfusion injury，I/R)損傷過程中，內皮細胞比心肌細胞更容易發生損傷，內皮損傷引發炎性細胞浸潤，微血栓形成等級聯效應，加速心肌細胞的I/R損傷，最終導致心肌壞死，功能失調[2-3]。

燈盞花素又名野黃芩苷(scutellarin，Scu)可以促進神經營養因子的合成和釋放從而緩解缺氧/復氧對星形膠質細胞的損害[4]。燈盞花素通過抑制小膠質細胞的過度激活，減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，抑制核易位和DNA 結合核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)活性，對腦損傷具有治療作用[5]。研究者的既往研究表明，燈盞花素能夠減小I/R損傷小鼠心肌梗死面積，增加心臟射血分數，降低血清心肌酶肌鈣蛋白I水平，抑制心肌細胞和腦細胞凋亡，抑制炎癥因子損傷，增加細胞活力。在此基礎上我們進一步研究燈盞花素對I/R損傷內皮細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料人微血管內皮細胞(microvascular endothelium cell，MEC)購于上?？道噬锟萍加邢薰?。內皮細胞培養基(endothelial cell culture medium，ECM)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，L-谷氨酰胺的衍生物(L-glutamine derivative，Glut MAX)，β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，0.05% 胰酶-乙二胺四乙酸(pancreatin-ethylenediaminetetraacetic acid，trypsin-EDTA)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購買于Gibco公司。噻唑藍(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)，表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)，堿性纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購買于Millipore公司。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)逆轉錄試劑盒為天根生物公司產品。KG-501、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD,貨號19160)、丙二醛(malondialdehyd，MDA，貨號MAK085)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH，貨號MAK066)，購自Sigma公司。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為碧云天生物公司產品。SYBR Green Master 購買于ABI公司。燈盞花素為北京原葉生物科技有限公司(HPLC≥95%)產品。環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB,貨號9197)及Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4，貨號14358)購于Cell Signaling 公司。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3，貨號ab192890)購買于Abcam生物公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP，貨號CW0103)購買于北京康為試劑公司。LC3，半胱天冬蛋白酶3(caspase-3)，細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及GAPDH基因引物由Invitrogen公司合成。ICAM-1 :F:5′-GGCGTCCATTTACACCTATTA-3′; R:5′-TTCCTTTTCTTCTCTTGCTTG-3′。VCAM-1:F:5′-CGGTCATGGTCAAGTGTTTG-3′; R:5′-GAG ATCCAGGGGAGATGTCA-3′。LC3:F:5′-AGCTCTG AAGGCAACAGCAACA-3′; R:5′-GCTCCATGCAGGT AGCAGGAA-3′。caspase-3:F:5′-ACCGATGTCGAT GCAGCTAA-3′; R:5′-GGTGCGGTAGAGTAAGCA TA-3′。GAPDH:F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′; R:5′-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3′。

1.2 MEC細胞培養及缺血/再灌注損傷模型制作

1.2.1細胞培養 使用6孔板培養MEC細胞(2×105/孔)，(MEC培養基成分：ECM，5% FBS，10 μg·L-1EGF，10 μg·L-1bFGF，2 mmol·L-1L-Glut MAX和0.1 mmol·L-1β-巰基乙醇)，24 h后換液。實驗細胞分為對照組(vehicle)、缺血/再灌注損傷組(I/R)、燈盞花素治療組(Scu+I/R)。

1.2.2I/R模型制作 6孔板培養的細胞在缺氧狀態下(條件為37 ℃，90% N2，5% O2，5% CO2的缺氧培養箱)中培養8 h，然后繼續復氧(置于正常培養箱)培養16 h。正常對照組MEC細胞始終在正常細胞培養箱中培養。燈盞花素治療組于缺血/再灌注開始前6 h將燈盞花素加入6孔板。

1.2.3KG-501及LPS配置 將KG-501 配制成儲存液(20 mmol·L-1)4 ℃儲存。將終濃度20 μmol·L-1的KG-501加入到MEC培養基。培養24 h后進行模型制作(燈盞花素治療模型及I/R模型)。

將LPS 配制成儲存液(1 mg·L-1)4 ℃儲存。使用時將其稀釋，終濃度100 μg·L-1。LPS加入培養基作用24 h后進行燈盞花素治療及I/R模型制作。

1.2.4MTT測定 使用96孔板培養MEC細胞(0.1×105細胞/孔)，體外培養56 h，加入5 g·L-1的MTT在37 ℃作用4 h，去除培養基，加入DMSO 150 μL/孔，室溫下搖床上孵育15 min，使用酶標儀(Turner BioSystems公司)450 nm測定吸光度。細胞活力/%=(吸光度/溶劑空白對照組吸光度)×100%。燈盞花素處理濃度為0、10、30、50、100 μmol·L-1。

1.2.5LDH活性測定 按照LDH測試盒說明書對MEC細胞培養液中LDH活性進行檢測。微孔法測量，設置標準孔(ODs)、空白孔(ODb)和測定孔(ODu)、對照孔(ODc)，使用酶標儀在450 mn測吸光度值，計算LDH值。

1.3 生化法測定MDA、SOD的表達PBS清洗MEC細胞后先加PBS(0.1 mol·L-1)和EDTA(0.05 mmol·L-1，pH 8.0)，再加入1%的Triton-X 100 50 μL，孵育1 min，加入25%的H3PO4100 μL，4 ℃離心1 h，取上清液，按說明書測定SOD及MDA水平。

1.4 RT-PCR測定使用TRIzol裂解液提取總內皮細胞RNA。根據試劑盒的操作步驟進行逆轉錄(RNA逆轉為cDNA)。依RT-PCR試劑盒指南進行cDNA擴增。

1.5 Western blot 分析細胞加入RIPA裂解液提取總蛋白經電泳、轉膜、封閉后加入一抗置于4 ℃冰箱孵育12 h，然后經HRP二抗(兔抗，使用濃度1 ∶2 000)孵育1 h。ECL顯影、成像，經過使用Image J軟件測定。一抗使用濃度為LC3(兔抗，使用濃度1 ∶1 500)，TLR4(兔抗，使用濃度1 ∶2 000)，CREB(兔抗，使用濃度1 ∶2 000)。

2 結果

2.1 燈盞花素修復I/R損傷內皮細胞的活力MTT測定發現：與對照組相比，I/R組細胞活力顯著降低(P<0.01)。在細胞I/R損傷前分別加入10、30、50、100 μmol·L-1的燈盞花素均有一定程度恢復MEC細胞活力，結果表明50 μmol·L-1燈盞花素具有最好的改善細胞活力的作用，見Fig 1。結果提示：燈盞花素使I/R損傷的MEC的細胞活力得到修復，活細胞數量增多，由于50 μmol·L-1效果最好，后續實驗燈盞花素劑量均使用50 μmol·L-1。

Fig 1 Changes in microvascular endothelial cell viability(n=5)

2.2 燈盞花素使I/R損傷微血管內皮細胞SOD表達增加，MDA、LDH表達減少對照組SOD水平高于I/R組(P<0.01)，MDA和LDH表達低于I/R組(P<0.01)。燈盞花素治療后，SOD表達顯著增加(與I/R組比較P<0.01)，同時MDA及LDH表達降低(與I/R組比較P<0.05)，見Tab 1。結果提示：對于I/R損傷的微血管內皮細胞，燈盞花素具有對抗氧化損傷的保護作用。

2.3 燈盞花素使I/R損傷的微血管內皮細胞ICAM-1及VCAM-1表達減少研究發現，I/R組ICAM-1mRNA及VCAM-1mRNA明顯增加(同對照組比較P<0.01)。與I/R組比較，燈盞花素治療組ICAM-1mRNA(P<0.01)及VCAM-1mRNA(P<0.05)表達減少，見Tab 1。結果提示：對于I/R損傷的微血管內皮細胞，燈盞花素具有緩解內皮損傷的作用。

2.4 燈盞花素使I/R細胞caspase-3 mRNA表達減少研究發現I/R組caspase-3 mRNA表達增加(同對照組比較P<0.01)。與I/R組比較，燈盞花素治療使caspase-3 mRNA表達減少，二者比較差異有統計學意義(P<0.01)，見Tab 2。結果提示，燈盞花素具有對抗I/R損傷的微血管內皮細胞凋亡的作用。

2.5 燈盞花素使I/R損傷的微血管內皮細胞自噬標準蛋白LC3表達增加與對照組相比，I/R組LC3 mRNA及蛋白表達均降低(P<0.05和P<0.01)。與I/R組比較，燈盞花素治療組LC3 mRNA及蛋白表達均增高(P<0.05)，見Tab 2，Fig 2。結果提示：I/R損傷模型組細胞自噬減少，細胞修復能力受到破壞，燈盞花素促進微血管內皮細胞自噬及細胞自我修復。

Fig 2 Protein expression of LC3

Tab 1 Changes of SOD,MDA,LDH,ICAM-1 mRNA and VCAM-1mRNA in MEC

Tab 2 Changes of caspase-3,LC3,CREB and TLR4 in MEC

2.6 燈盞花素抑制I/R損傷的微血管內皮細胞TLR4表達，增加CREB表達與對照組相比，I/R組TLR4表達增加(P<0.01)，CREB表達降低(P<0.01)。燈盞花素治療使TLR4表達減少(與I/R組比較P<0.05)，CREB表達增高(與I/R組比較P<0.05)，見Tab 2，Fig 3。結果提示：燈盞花素可能通過CREB及TLR4通路對I/R損傷的微血管內皮細胞發揮促進自噬，抑制凋亡作用

2.7 抑制CREB表達使燈盞花素治療的I/R微血管內皮細胞LC3表達減少，抑制自噬與Scu+I/R組相比，Scu+I/R組加入CREB抑制劑(KG-501)后CREB表達減少(P<0.05)；LC3mRNA及蛋白表達減少(P<0.05)，見Tab 2，Fig 2,3。結果顯示：KG-501有效抑制CREB表達，CREB表達減少后使自噬減少，進一步印證燈盞花素可能通過調控CREB表達對I/R損傷的微血管內皮細胞發揮促進自噬作用。

2.8 激動TLR4表達使燈盞花素治療的I/R微血管內皮細胞凋亡增加與Scu+I/R組比較，將TLR4激動劑(LPS)加入Scu+I/R組后，TLR4表達增加(P<0.05)，caspase-3 mRNA表達增加(P<0.05)，見Tab 2，Fig 3。進一步印證燈盞花素可能通過TLR4通路對I/R損傷的微血管內皮細胞發揮抑制凋亡作用。

Fig 3 Protein expression of CREB and TLR4

3 討論

通過血運重建恢復缺血或梗死區域的血液灌注是治療心肌梗死首要方法，然而冠狀動脈阻塞區域血管的再通并不意味著恢復了心臟組織的有效灌注。微血管內皮細胞是微循環系統的最基本單位，微血管內皮細胞與心肌細胞之間的最小距離約1-2 μm。內皮細胞舒縮能夠調節微血管直徑，進而調節周圍心肌組織血流分配，通過旁分泌和自分泌方式調節心肌代謝及功能。心肌缺血/再灌注損傷的病理特點之一是微循環損傷，氧自由基在I/R誘導的微循環損傷中起主要作用，I/R會導致氧自由堆積。細胞膜及胞內DNA、蛋白質、脂肪均會受到氧自由基攻擊，導致內皮細胞結構和功能受損[6-7]，進一步發生細胞凋亡或壞死。

MTT通過測定活細胞的線粒體代謝水平來反映細胞活力。本研究發現I/R損傷導致MEC活力減低，燈盞花素治療使MEC活力恢復，其中50 μmol·L-1燈盞花素劑量為最優選擇。本結果說明燈盞花素修復MEC線粒體，增加活細胞數量，提高細胞活力。

SOD作為抗氧化酶具有清除氧自由基，緩解氧化損傷的作用。MDA是脂類物質發生過氧化反應產生的代謝產物，是反映組織過氧化損傷程度的客觀指標。LDH主要參與無氧酵解，對細胞受損敏感，可以作為反映細胞損傷程度的指標。本研究指出I/R損傷引起MEC抗氧化能力降低，易發生過氧化反應，誘發細胞氧化損傷發生。燈盞花素使I/R損傷的MEC的SOD表達增加，MDA及LDH表達減少，提示燈盞花素能夠對抗過氧化反應，緩解過氧化損傷。

I/R損傷導致白細胞向血管內皮細胞遷移，黏附于血管內皮并釋放活性氧產物和蛋白酶，誘發心肌損傷。繼而白細胞滲出到再灌注區域，通過炎癥級聯效應誘發缺血區再損傷。大量的白細胞黏附于內皮細胞造成微血管堵塞，進一步加重心肌損傷。細胞黏附糖蛋白主要包含ICAM-1和VCAM-1。ICAM-1介導中性粒細胞與內皮細胞黏附，VCAM-1與單核細胞與內皮的黏附有關。生理狀態下，血管內皮細胞較少表達ICAM-1和VCAM-1。腦缺血時內皮細胞大量分泌ICAM-1和VCAM-1，誘導單核細胞及中性粒細胞遷移，滲出，導致缺血區域發生再損傷[8]。I/R產生的活性氧導致內皮細胞損傷，ICAM-1和VCAM-1分泌增多使內皮屏障功能障礙，微血管通透性增加，白細胞黏附，血管炎癥及粥樣斑塊破碎形成血栓[9-10]?；罨闹行粤＜毎高^內皮細胞向心肌組織浸潤，使心肌損傷加重。本研究發現燈盞花素使I/R損傷的MEC產生的ICAM-1和VCAM-1減少，有助于減輕白細胞黏附及炎性損傷，可能會避免毛細血管狹窄及血栓形成。

自噬是細胞內“自我平衡的動態循環”過程，通過吞噬、分解損傷物質為細胞提供合成新物質的原料及能源，促進細胞在“能源不足”狀態下保持存活。損傷性刺激會導致自噬通路活化，形成自噬溶酶體，清除受損DNA、蛋白質、細胞器，增加細胞抵抗損傷的能力[11]。本研究發現燈盞花素使I/R損傷的MEC的自噬標準蛋白LC3表達增高。在哺乳動物中，LC3是自噬的標志性蛋白。當LC3與其配體蛋白p62結合后形成自噬體，誘發自噬級聯反應。本研究發現燈盞花素能夠修復損傷的線粒體，恢復線粒體功能，使細胞活力增加，同時使LC3增加，啟動自噬程序，修復受損細胞對抗氧化損傷。

CREB屬于DNA結合轉錄因子，與順式作用元件結合，調控多種下游基因轉錄。研究證實，轉錄因子CREB通路在細胞增殖、神經元再生、突觸形成及學習記憶，損傷修復等多方面起重要作用[12-13]，自噬相關基因亦受CREB調控[14]。本研究亦發現I/R使MEC的CREB表達減少，燈盞花素治療CREB得到提高。為了驗證燈盞花素是否通過調節CREB表達促進MEC自噬，我們將CREB抑制劑加入燈盞花素治療的I/R細胞發現LC3表達減少，抑制了自噬。因此本研究提出燈盞花素可能通過促進CREB表達抑制I/R損傷的微血管內皮細胞自噬。

caspase-3處于凋亡有序級聯通路的下游，線粒體途徑和死亡受體途徑均激活caspase-3。caspase-3激活標志著凋亡不可逆轉。我們研究結果發現燈盞花素治療可以使caspase-3 mRNA表達減少，抑制I/R導致的MEC凋亡。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)在心臟中表達水平最高，主要參與心肌組織損傷及凋亡[15]。敲除TLR4 基因可以減少大鼠心肌梗死面積，抑制TLRs下游分子表達具有減輕心肌I/R損傷的作用，TLR4信號通路在心肌I/R損傷中起關鍵調控作用[16]。研究者的既往研究表明，燈盞花素能夠減小缺血/再灌注損傷小鼠心肌梗死面積，增加心臟射血分數，降低血清心肌酶肌鈣蛋白I水平，抑制心腦細胞凋亡，抑制炎癥因子損傷，增加細胞活力。燈盞花素可能是通過調控TLR4 基因抑制I/R損傷的心肌細胞凋亡。本研究測定了TLR4在MEC的表達變化，發現I/R損傷使TLR4表達增加，燈盞花素治療后TLR4表達減少。為了驗證燈盞花素是否通過調控TLR4表達抑制I/R損傷的MEC凋亡，研究者在燈盞花素治療的I/R細胞中加入TLR4激動劑，發現caspase-3表達增加。因此推測燈盞花素可能是通過抑制TLR4表達發揮抗凋亡作用。

既往研究發現，燈盞花素可以增加大鼠腦微血管內皮細胞糖氧剝奪模型的組織纖溶酶原激活物和擴血管物質釋放，抑制組織纖溶酶原激活劑抑制物和縮血管物質內皮素的生成，使炎癥指標TNF-α、IL-1β、IL-6下降[17]。燈盞花素能夠對抗原代培養的新生大鼠心肌細胞的缺氧/復氧損傷，降低LDH和MDA的 含量，增加SOD和 GSH-PX 的活性，以起到心肌保護作用[18]。本研究發現燈盞花素可以提高缺血/再灌注損傷的微血管內皮細胞活力、使氧化損傷指標LDH、MDA減少，抗氧化指標SOD增加，與既往研究具有部分一致性，但二者研究對象不同。同時，首次提出燈盞花素可以減少內皮細胞I/R損傷模型ICAM-1和VCAM-1的釋放，有助于減輕白細胞黏附及炎性損傷，可能會避免毛細血管狹窄及血栓形成、減輕微血管炎性損傷。并且指出燈盞花素是通過促進CREB表達促進自噬，通過抑制TLR4表達抑制凋亡，從而發揮對內皮細胞I/R損傷模型的保護作用。