新型磷酸二酯酶4抑制劑ZL-n-91對人神經膠質瘤細胞增殖、周期及凋亡的影響

李玉玉，毛 萍，趙正剛，李美蓉，趙夏楠，李芳紅，周素瑾，趙子建

(廣東工業大學生物醫藥學院，廣東 廣州 510006)

神經膠質瘤是最常見的原發性惡性腦腫瘤，具有侵襲性強、預后差等特點[1-2]。2018年流行病學統計，我國神經膠質瘤的年發病率為(5-8)個/10萬，5年死亡率在所有腫瘤中位居第三，僅次于胰腺癌和肺癌[3]。盡管近幾年在膠質瘤的診斷和治療方面取得了很大的進步，但對于高級別膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的預后仍不理想，患者兩年生存率僅為26%-33%[4]。因此，尋找新型高選擇性的靶向治療藥物極為重要。

磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)是PDE家族中重要成員，能夠特異性水解環磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)。而腦腫瘤組織中的cAMP水平明顯低于正常腦組織[5]。此外，研究表明[6-7]，PDE4抑制劑咯利普蘭(rolipram)通過提高細胞內cAMP水平能抑制腦腫瘤的生長，但由于其惡心、嘔吐等嚴重的副作用而限制了進一步的開發和應用[8-9]。尋找新的副作用小且有效的PDE4抑制劑對腦腫瘤的治療和防治具有重要意義。

ZL-n-91是基于第二代PDE4抑制劑設計而成的新型選擇性PDE4抑制劑，對PDE4的抑制作用高于咯利普蘭，且對PDE4B和PDE4D的選擇性是其他PDE家族成員的5 000倍[10]。因此，ZL-n-91具有針對性強，選擇性高，副作用小，能有效減弱甚至避免嘔吐等不良反應的優點[10]。已有研究表明ZL-n-91對前列腺癌具有一定治療效果[11]。此外，ZL-n-91對阿爾茨海默病等腦損傷具有保護作用且可有效穿透血腦屏障[12]。因此，本研究利用新型PDE4抑制劑ZL-n-91，通過體內外研究探討其對神經膠質瘤增殖的抑制作用，以期為臨床治療神經膠質瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與動物 人膠質瘤U87細胞購買于中國科學院上海細胞庫。6周齡，♀，體質量(15-20)g的BALB/c-nu裸鼠，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2019-0010。

1.1.2藥物與試劑 ZL-n-91 由藥明康德公司合成；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶購自美國Gibco公司；DMSO購買于美國sigma aldrich；CCK-8(cell counting kit-8，批號：G909FA003)購自上海生物工程有限公司；碘化丙啶(PI，批號：9039585)、PE Annexin V/7-AAD(批號：9074586)試劑購自美國BD公司。B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl相關蛋白(Bax)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、Ki67抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3儀器 AC2-4S1型二級生物安全柜(ESCO，新加坡)；CLM-170B-8-NF型二氧化碳培養箱(ESCO，新加坡)；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，中國)；流式細胞儀(DXP AthenaTM，美國)；ChemiDoc+XRS化學發光凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)；Leica倒置顯微鏡(Leica德國)；CMAXPLUS+酶標儀(美國)；-80 ℃冰箱(美菱，中國)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人膠質瘤U87細胞用含10%胎牛血清DMEM 培養基，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件的培養箱中培養。細胞呈單層貼壁生長，及時更換培養液，每2-3 d傳代一次，取對數生長期的細胞，消化并吹打制成細胞懸液，按所需濃度接種使用。

1.2.2CCK-8 法檢測細胞增殖活性 將生長良好的U87細胞制備成單細胞懸液接種于96 孔板(3×104個/孔，每孔100 μL)，置于培養箱培養。實驗共分為9組：空白對照組，溶劑對照組和50、100、200、300、400、500、600、800 μmol·L-1的ZL-n-91組。將96孔板過夜培養待細胞貼壁后，更換加入相應濃度ZL-n-91藥物的培養基；繼續培養48 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，避免產生氣泡，避光孵育1-2 h，取出，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度(A值)并計算細胞增值抑制率，采用GraphPad Prism 7.0軟件計算藥物的IC50。

細胞增殖率/%=(A給藥組-A空白組)/(A溶劑對照組-A空白組)×100%；

細胞抑制率/% =[1-細胞增殖率(%)]×100%

1.2.3PI單染法檢測細胞周期 取對數生長期的U87細胞，用無血清的基礎培養基重懸，以2×108個/L接種于6孔培養板，置于培養箱培養，饑餓處理24 h；更換含有血清培養基，加入ZL-n-91(溶劑對照組，150 μmol·L-1，200 μmol·L-1)處理24 h；胰酶消化、離心、收集細胞，PBS洗滌離心后，加入1 mL體積分數為0.75的預冷乙醇，置于-20 ℃固定24 h以上；洗滌離心，按試劑盒說明書加入500 μL PE染色，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀進行周期檢測，用ModiFit LT 5.0軟件進行細胞周期分析。

1.2.4PE Annexin V/7-AAD檢測細胞凋亡 取對數生長期的U87細胞，以2×108個/L接種于6孔培養板；鋪板24 h后，分別加入ZL-n-91(溶劑對照組，150、200、300 μmol·L-1)，將細胞繼續培養48 h；消化離心收集細胞，用1×Binding buffer制備成1×109個/L的細胞懸液，分別加入5 μL 7-AAD和5 μL PE染色，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，1 h內進行流式細胞檢測，用Flow Jo V10分析軟件分析結果。

1.2.5Western blot檢測細胞周期、凋亡相關蛋白表達 用150、200、300 μmol·L-1ZL-n-91分別處理U87細胞48 h，RIPA裂解液裂解細胞，12 000×g離心15 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。5×上樣緩沖液稀釋，煮沸10 min。取等量蛋白樣品在質量分數10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳，轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加一抗β-actin(1 ∶5 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、CDK2(1 ∶1 000)、CDK4(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶1 000)，4 ℃過夜孵育。TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，ECL發光儀曝光。采用ImageJ軟件分析目的條帶的相對表達水平。

1.2.6Ki67免疫組織化學染色 取新鮮腫瘤組織經固定、脫水、包埋后制備成石蠟切片，將腫瘤組織切成4 mm切片，經60 ℃烤片1.5 h，放入二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，在0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中微波修復，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物活性，用正常山羊血清室溫封閉。Ki67抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h，DAB顯色，蘇木精復染3 min、鹽酸酒精分化數秒、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7動物建模及給藥 小鼠在廣東藥科大學動物實驗中心SPF實驗室飼養，飼養室溫24 ℃，相對濕度45%-55%，實驗設計及實驗操作由廣東藥科大學動物倫理委員會審查和批準，動物倫理編號SPF2017027。在進行實驗前適應性喂養1周。

取對數生長期的U87細胞，用無血清DMEM培養基制備濃度為2.5×1010個/L的單細胞懸液接種于雌性裸鼠右側腋下，每只裸鼠接種0.1 mL(含2.5×106個細胞)。待腫瘤體積達到100 mm3左右時，將荷瘤小鼠隨機分組：溶劑對照組和5 mg·kg-1ZL-n-91藥物組。每天進行灌胃治療，每兩天測量裸鼠體重、腫瘤體積，計算腫瘤體積(V=0.52×長徑×寬徑2)，繪制裸鼠體重和腫瘤體積增長曲線。當對照組小鼠腫瘤體積達到1 500 mm3時，實驗周期結束，麻醉處死小鼠，剝瘤稱質量，拍照。

研究中使用的ZL-n-91為5mg·kg-1由質量分數為40% 羥丙基-β-環糊精和6%聚乙二醇硬脂酸酯溶于生理鹽水配制而成，給藥方式為灌胃給藥。

2 結果

2.1 ZL-n-91抑制U87細胞增殖CCK-8檢測不同濃度ZL-n-91(50、100、200、300、400、500、600、800 μmol·L-1)處理神經膠質瘤U87細胞48 h后，顯著抑制細胞增殖(P<0.01)，且隨著ZL-n-91濃度的增加，其抑制增殖的作用進一步加強(Fig 1)。計算ZL-n-91對U87細胞的半數抑制濃度(IC50)為274.5 μmol·L-1。以上結果表明ZL-n-91對神經膠質瘤U87的增殖具有明顯抑制作用。

2.2 ZL-n-91對U87細胞周期的影響PI單染檢測結果顯示，與對照組相比，150、200 μmol·L-1ZL-n-91處理U87細胞24 h，G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.01)，S期細胞比例顯著下降(P<0.05，P<0.01)(Fig 2A,B)。Western blot結果顯示，與溶劑對照組相比，ZL-n-91處理組細胞周期蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1的表達量下調(Fig 2C,D)。以上結果表明ZL-n-91將U87細胞阻滯在G0/G1期。

Fig 1 Effect of ZL-n-91 on viability of U87 cells

2.3 ZL-n-91對U87細胞凋亡的影響利用Annexin V-PE/7-AAD標記U87細胞進行流式細胞凋亡檢測，結果顯示，經150、200、300 μmol·L-1ZL-n-91處理后，U87細胞凋亡程度增加(Fig 3A)，細胞凋亡率分別是11.08%±3.38%、14.49%±0.46%(P<0.05)、44.12%±5.87%(P<0.01)(Fig 3B)，表明ZL-n-91能夠效誘導神經膠質瘤細胞凋亡且呈現濃度依賴性。Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，ZL-n-91藥物處理組抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達沒有明顯差異(Fig 3C)，但Bcl-2/Bax比值下降(Fig 3D;P<0.05)。以上結果表明ZL-n-91能夠促進神經膠質瘤U87細胞的凋亡，可能通過Bcl-2/Bax途徑誘導細胞凋亡。

Fig 2 Effects of ZL-n-91 on cell cycle distribution of U87 cells

2.4 ZL-n-91對U87裸鼠異種移植瘤生長的影響為了研究ZL-n-91的體內抗腫瘤作用，構建了U87裸鼠皮下移植瘤模型。當腫瘤體積達到100 mm3左右，隨機分組開始給藥治療。從給藥d 22起，與溶劑對照組相比，給藥組小鼠的腫瘤體積顯著小于對照組(Fig 4A,P<0.05)。在治療期結束，剝離腫瘤并稱重，結果顯示，給藥組小鼠腫瘤重量明顯小于對照組(Fig 4B,C;P<0.01)。在整個治療期間，兩組小鼠的體重差異無顯著性(Fig 4D)。以上結果提示，ZL-n-91可以顯著抑制神經膠質瘤U87細胞裸鼠移植瘤生長。

2.5 免疫組化檢測Ki67表達情況Ki67是細胞增殖的標志物。免疫組化結果顯示(Fig 5)，與溶劑對照組相比，給藥組腫瘤組織的Ki67陽性率降低(P<0.01)，該結果進一步表明ZL-n-91能有效抑制膠質瘤的增殖。

Fig 3 Effects of ZL-n-91 on cell apoptosis of U87 cells

Fig 4 Effects of 5 mg·kg-1 ZL-n-91 on U87 subcutaneous transplanted tumor

Fig 5 Expression of Ki67 of tumor tissues

3 討論

神經膠質瘤是常見的原發性惡性腫瘤，手術難以完全切除病灶[13]，而化療藥物治療效果有限，且具有副作用大，易產生耐藥性等缺點[14]。盡管近年來在神經膠質瘤治療方面取得較大的進步，但仍缺乏特異性和有效的藥物。本研究首次利用新型的PDE4抑制劑ZL-n-91治療神經膠質瘤，通過體內外研究證實其對人神經膠質瘤具有抗腫瘤活性，有效抑制神經膠質瘤U87細胞增殖，將U87細胞阻滯在G0/G1期并誘導細胞凋亡。

PDE4亞型表達水平在神經膠質瘤中顯著升高，表明PDE4對神經膠質瘤的生長具有正向調節作用[6]。由于新型PDE4抑制劑ZL-n-91具有對PDE4的更強的抑制作用、選擇性高、副作用低以及可以通過血腦屏障等優勢[10-12]，提示ZL-n-91對神經膠質瘤的治療具有良好的應用前景。本研究發現，ZL-n-91有效的抑制了神經膠質瘤細胞的增殖，通過體內試驗證明，每日灌胃5 mg·kg-1ZL-n-91藥物有效抑制裸鼠皮下神經膠質瘤的生長，且對小鼠沒有產生明顯的毒副作用，該結果為ZL-n-91臨床治療神經膠質瘤提供了可能。

本研究發現ZL-n-91將神經膠質瘤細胞阻滯在G0/G1期。細胞周期調控有多重基因蛋白參與調控，周期蛋白依賴性激酶(CDK)的表達及活性是調控細胞周期的核心。其中CDK2和CDK4主要作用于G1和S時期，具有啟動DNA復制和誘發有絲分裂的雙重作用。Cyclin D1通過結合并激活G1期特有的CDK4，使G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，從而推動細胞周期由G1進入S期[15]。本研究結果顯示，ZL-n-91能夠明顯下調CDK2、CDK4、Cyclin D1蛋白的表達，這也是ZL-n-91將膠質瘤細胞阻滯在G0/G1期的主要原因之一。

本研究還發現ZL-n-91能夠呈劑量依賴的促進神經膠質瘤細胞的凋亡。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中兩種互為拮抗的凋亡蛋白，通過調控線粒體膜的通透性在細胞凋亡中發揮重要作用[16]。Bcl-2可與Bax形成二聚體，兩者的比例失調是啟動細胞凋亡的開關。當Bcl-2/Bax比值上調時，抑制細胞凋亡；反之，促進細胞凋亡[17]。本研究證實 ZL-n-91可以通過調控Bcl-2、Bax的表達，降低Bcl-2/Bax比值。因此，ZL-n-91可能通過Bcl-2/Bax途徑誘導神經膠質瘤U87細胞的凋亡。

綜上所述，新型PDE4抑制劑ZL-n-91能夠顯著抑制膠質瘤細胞增殖，阻滯周期進展，促進膠質瘤細胞凋亡，本研究為開發PDE4抑制劑作為抗神經膠質瘤的研究提供了一定的理論基礎。