超聲波輔助提取魚腥草總黃酮的工藝研究

黃明才，韋國蘭，龍杰鳳，王 翔，陸勤猛

（凱里學院，貴州 凱里 556011）

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的新鮮全草或干燥地上部分，始載于《名醫別錄》，是一種藥食兩用的植物.《中國藥典》中記載魚腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效，臨床上用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒等疾?。?］；在食用上常以炒、涼拌等方式見于云貴川幾大省份人民的餐桌上.魚腥草主要含黃酮、揮發油、酚酸、萜類、生物堿等成分［2-3］，現代藥理研究表明魚腥草中黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗誘變和清除自由基等功能［4］.本試驗以魚腥草為原料，采用超聲波輔助提取法對魚腥草中總黃酮提取工藝進行優化，以期為魚腥草的進一步研究提供技術依據.

1 試驗材料、試劑、儀器與方法

1.1 試驗材料與試劑

樣品魚腥草購于凱里市中藥材市場，去雜質清洗后曬干，置于烘箱中60℃干燥至恒重，再放入高速萬能粉碎機中進行粉碎，過40 目篩，得到40 目樣品粉末放入密封袋避光保存，待用.所用試劑為蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯等.

1.2 試驗儀器

本試驗所用儀器有電熱鼓風干燥箱（WGLL-230BE，天津市泰斯特儀器有限公司），高速萬能粉碎機（FW400A，北京科偉永興儀器有限公司），超聲波清洗機（JP-040，深圳市潔盟清洗設備公司），低速離心機（TD5M，長沙湘智離心機儀器有限公司），紫外分光光度計（UV-2550，島津企業管理中國有限公司），電子天平（AR224CN，奧豪斯儀器（常州）有限公司）等.

1.3 試驗方法

1.3.1薄層色譜鑒別

取魚腥草粉末0.4 g放入50 mL 的小燒杯中，然后加入10 mL 甲醇封口超聲5 min 后放至室溫過濾，濾液保存作為供試品.

精確稱量8.0 mg蘆丁粉末，放入錐形瓶，然后加入2.0 mL甲醇得到對照品溶液（4 mg/mL）.

硅膠G 薄板層110 ℃下活化120 min，用毛細管蘸取樣品溶液點樣，在G 薄板層取5 個點分別在1、3、5 號點上點入供試品，在2、4 號點上點入對照品，然后放入盛有展開劑乙酸乙酯∶甲酸∶水（8∶1∶1）的展缸中，10～30 min后取出，放置烘箱烘干，然后在薄層板噴上三氯化鋁溶液，放入暗箱三用紫外線分析儀在紫外燈365 nm 下檢視［5］.結果可見對照品與供試品在相應的位置下顯示顏色相同的綠色熒光斑點，證明魚腥草中含有黃酮成分.

1.3.2測定波長的選擇

精密稱取1.2 mg 的蘆丁對照品，加入100 mL 的容量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，即配制濃度為0.012 mg/mL的蘆丁對照品，在紫外-可見光光譜儀200～800 nm波長下掃描，結果在512 nm處有最大吸收峰，因此在測定魚腥草總黃酮含量時，在此波長處測定.

1.3.3標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線的制作參照文獻［6］：準確稱取0.126 g 蘆丁標準品于150 mL 燒杯中，并用100 mL 的70%乙醇溶液溶解后轉移至1000 mL 容量瓶中，并定容至刻度，搖勻靜置.分別吸取該標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于5 個25 mL 比色管中，再分別加入70%乙醇溶液至5.0 mL，混合均勻，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混合均勻，靜置6 min，加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，放置6 min，再加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，混合均勻.放置15 min，并于510 nm 波長處測定其吸光度.以蘆丁濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線.其回歸方程為Y=11.701X-0.0057（R2=0.9996）.由此可見，此方程線性良好.

1.3.4魚腥草總黃酮得率的結果計算

魚腥草總黃酮得率通過以下公式計算：總黃酮得率（%）=（C×V×稀釋倍數）×100/M，式中C為標準樣液濃度（mg/mL），V為樣品體積（mL），M為稱取樣品質量（mg）

1.3.5魚腥草總黃酮提取的單因素考察

1.3.5.1料液比對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g魚腥草粉末5份，放入相應的5個250 mL圓底燒瓶中，以40%乙醇溶液為提取劑，以按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25為料液比，用保鮮膜封口，在溫度為40 ℃條件下超聲提取15 min 后放置室溫，抽濾，濾液轉入100 mL容量瓶定容至刻度，根據1.3.3測定其吸光度.

1.3.5.2乙醇濃度對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g 魚腥草粉末5 份，放入相應的5 個250 mL 圓底燒瓶中，按固定料液比為1∶10比例分別加入50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇，用保鮮膜封口，在溫度為40 ℃條件下超聲提取15 min后放置室溫，抽濾，濾液轉入100 mL容量瓶定容至刻度.根據1.3.3測定其吸光度.

1.3.5.3提取時間對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g魚腥草粉末5份，放入相應的5個250 mL圓底燒瓶中，按固定料液比為1∶10加入70%的乙醇，用保鮮膜封口，在溫度為40 ℃條件下超聲提取時間依次為15、30、45、60、75 min后，放置室溫，抽濾，濾液轉入100 mL容量瓶定容至刻度，根據1.3.3測定其吸光度.

1.3.5.4提取溫度對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0g魚腥草粉末5份，放入相應的5個250 mL圓底燒瓶中，按固定料液比為1∶10加入70%的乙醇，設置超聲溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，超聲提取30 min 后，放置室溫，抽濾，濾液轉入100 mL容量瓶定容至刻度，根據1.3.3測定其吸光度.

1.3.6正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交實驗優化提取工藝參數，因素水平表見表1.

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 因素試驗結果

2.1.1料液比對魚腥草總黃酮提取的影響

根據圖1 可知，當料液比為1∶5 至1∶10 時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當料液比為1：10時總黃酮得率最大，隨后慢慢降低，故正交試驗設計中選取提取料液比為1∶5～1∶15.

圖1 料液比不同對總黃酮提取的影響

2.1.2乙醇濃度對魚腥草總黃酮提取的影響

根據圖2 可知，當乙醇濃度為50%～70%時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當料液比為70%時總黃酮得率最大，隨后慢慢降低，故正交試驗設計中選取提取乙醇濃度為60%～80%.

圖2 不同乙醇濃度對總黃酮提取的影響

2.1.3提取時間對魚腥草總黃酮提取的影響

根據圖3 可知，當超聲提取時間為15～30 min 時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當超聲提取時間達30～45 min時，總黃酮得率沒有變化，這時得率最大，45 min后總黃酮得率逐漸降低，故正交試驗設計中選取提取時間為15～45 min.

圖3 提取時間不同對總黃酮提取的影響

2.1.4提取溫度對魚腥草總黃酮提取的影響

根據圖4 可知，當提取溫度在40℃～50℃時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當提取溫度達50℃時，這時總黃酮得率最大，50℃后總黃酮得率逐漸降低.故正交試驗設計中選取提取時間為40℃～60℃.

圖4 提取溫度不同對總黃酮提取的影響

2.2 魚腥草總黃酮提取工藝的優化

在單因素試驗結果的基礎上設計正交試驗方案，選取各因素中魚腥草總黃酮得率較高3 個水平進行正交試驗，正交實驗結果見表2.

表2 正交試驗方案及結果

由表2中極差分析可知，4個因素對魚腥草總黃酮提取效果影響的主次順序為A（料液比）＞C（提取時間）＞D（提取溫度）＞B（乙醇濃度），最佳工藝為A2B2C3D3，即料液比為1∶10、乙醇濃度為70%、提取時間為45 min、提取溫度60℃.故對A2B2C3D3進行驗證實驗，驗證實驗結果總黃酮得率為2.53%.

3 結論

本研究在考察單因素料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度的基礎上，采用正交設計對魚腥草總黃酮提取工藝進行優化，得到魚腥草總黃酮的最佳工藝為A2B2C3D3，即料液比為1∶10、乙醇濃度為70%、提取時間為45 min、提取溫度60℃，此方法便捷、快速、低成本，可為魚腥草的開發提供一定的參考依據.