蘆丁在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學行為及其與DNA的相互作用

尚永輝, 劉 彬，古元梓

(咸陽師范學院化學與化工學院,陜西咸陽 712000)

蘆丁是一種自然界中常見的黃酮醇類化合物，多存在于煙葉、棗、杏、橙皮、番茄、蕎麥花等植物中，具有抗炎、抗病毒、抗衰老、抗癌等多種功效[1,2]。目前文獻報道蘆丁的測定方法主要有高效液相色譜法[3]、毛細管電泳法[4]、流動注射化學發光法[5]等。脫氧核糖核酸(DNA)是生物體遺傳信息的重要載體，與生物體的生長,發育以及病變過程息息相關，深入研究藥物小分子與DNA的相互作用信息有助于從分子水平上了解生命現象的本質[6]。

本文探討了蘆丁在多壁碳納米管修飾碳糊電極(MWCNTs/CPE)上的電化學行為，在此基礎上研究了蘆丁與DNA的相互作用信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C型電化學工作站(上海辰華儀器公司)；RF5301型熒光光譜儀(日本，島津公司)；CH2250型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；KQ520DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；三電極系統：MWCNTs/CPE為工作電極，Hg/Hg2Cl2電極為參比電極，鉑電極為輔助電極。

1.0×10-3mol/L蘆丁溶液：稱取0.0305 g蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所)用乙醇在50 mL燒杯里攪拌至完全溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容備用。604 μg/mL DNA溶液：準確稱取0.0151 g鯡魚精DNA(fsDNA,美國Sigma公司)用蒸餾水完全溶解，定量轉移至50 mL容量瓶中定容，0～4 ℃保存備用。1.0×10-3mol/L中性紅溶液：稱取0.0144 g中性紅(純度大于99%，上海試劑三廠)，用蒸餾水溶解，定量轉移至100 mL容量瓶中定容，備用。實驗用水為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1修飾電極的制備稱取適量石墨粉于研缽中，滴加液體石蠟并充分研磨，至呈有一定韌性的小片狀，填入0.5 mL注射器中，壓實，從另一端插入一根打磨過的銅絲作為導線，即制得碳糊電極(CPE)，將電極在稱量紙上打磨拋光，備用。稱取5 mg經混酸處理過的MWCNTs粉末(>98%,成都有機研究所)，加入5 mL DMF并置于試管中，用數控超聲波清洗器進行超聲分散2 h，使其均勻分散。取適量滴至拋光好的CPE上，紅外燈烘干，備用。

1.2.2電化學測定準確移取一定量蘆丁儲備液于10 mL比色管中，加入pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液3.0 mL，用去離子水定容，以MWCNTs/CPE為工作電極，用三電極系統測定，記錄循環伏安曲線和微分脈沖伏安曲線。

1.2.3光化學測定準確移取一定量的蘆丁標準溶液，移取pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液3.0 mL，加入一定量DNA溶液，定容到10 mL，搖勻，放置1 h后，用熒光光譜儀以306 nm為激發波長，狹縫寬度均為5.0 nm，測定350～750 nm的發射光譜。

2 結果與討論

2.1 蘆丁在MWCNTs/CPE上的電化學行為

實驗考察了蘆丁分別在CPE和MWCNTs/CPE上的電化學行為，結果見圖1。2.0×10-4mol/L蘆丁在CPE以及MWCNTs/CPE兩個電極上的氧化峰、還原峰電位均在0.508 V和0.438 V，峰電位無明顯移動；但在修飾電極上的電流信號明顯強于CPE，其中在修飾電極上的氧化峰電流信號是CPE上的2.15倍，還原峰電流信號是CPE上的1.95倍，表明對蘆丁具有明顯的催化作用。

2.2 實驗條件優化

2.2.1最佳pH值實驗考察了蘆丁在不同pH的B -R緩沖溶液中的電化學行為，結果見圖2。由圖2可知：隨著pH的增加，蘆丁的氧化峰、還原峰峰電位均線性負移，其中氧化峰電位與pH的線性關系為:Epa=-0.0648pH+0.6997(r=0.9980)，表明蘆丁在MWCNTs/CPE上的電極反應過程有質子參與，依據Epa=E0-0.059(m/n)pH，計算得到：m/n=1，即m=n，可知該電極反應過程為等質子等電子反應過程[7]。實驗中pH=3.21時峰電流最大，且峰形最佳，實驗選擇pH為3.21。

2.2.2底液的選擇實驗考察了蘆丁分別在pH=3.21的B -R、檸檬酸-檸檬酸鈉、Na2HPO4-檸檬酸、鄰苯二甲酸-HCl、HAc-NaAc 5種緩沖溶液中的電化學行為，結果見圖3。研究發現蘆丁在pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中峰電流最大，峰形最好。實驗選擇pH=3.21 Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液為底液。

2.2.3掃描速率對電化學信號的影響實驗進一步考察了掃描速率對蘆丁電化學信號的影響，結果如圖4所示。由圖可知氧化峰電流、還原峰電流均隨掃描速率的增大而增加，其中氧化峰電流ipa與v呈現良好的線性關系，線性方程為：ipa(μA)=-5.731v(V/s)-3.3926(r=0.9985)，表明蘆丁在MWCNTs/CPE上的電化學氧化過程是受吸附控制的電極反應過程；氧化峰電位Epa與lnv呈良好的線性關系，線性方程

2.4 線性關系

在最佳實驗條件下,采用循環伏安法測定，蘆丁濃度在5.0×10-7～2.0×10-4mol/L范圍內與其氧化峰電流ipa呈良好的線性關系，線性方程為：ipa(μA)= 4.77c蘆丁(10-4mol/L)+1.4563(r=0.9990)，檢出限為2.0×10-7mol/L，應用該方法測定5.0×10-6mol/L的蘆丁溶液20次，相對標準偏差為4.58%。該方法具有靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，重現性好等優點，有望作為蘆丁測定的新方法。

2.5 蘆丁與DNA相互作用的研究

2.5.1蘆丁與DNA相互作用的電化學行為在最佳實驗條件下，固定蘆丁濃度為1.0×10-4mol/L，加入一定量DNA溶液，待兩者充分混合反應后，以MWCNTs/CPE為工作電極測定體系的微分脈沖伏安曲線，見圖5。由圖5可知，蘆丁的氧化峰電流隨DNA的加入明顯降低，峰電位逐漸正移，依據Bard[10]等人的經驗，推測蘆丁與DNA主要以嵌入作用為主；從分子結構上看，蘆丁的主體結構有多個羥基，為親水基團，易于DNA上的堿基發生相互作用。

2.5.2以中性紅為探針研究蘆丁與DNA相互作用具有平面吩嗪環特征的中性紅分子能與DNA發生嵌插作用[11]，為了進一步探究蘆丁與DNA的相互作用機理，實驗以中性紅作為電化學探針進行研究。實驗分別取一定量中性紅、中性紅與DNA，以及中性紅、DNA和蘆丁的混合溶液，靜置反應30 min后，分別測定體系的微分脈沖伏安圖(圖6(a))和熒光光譜圖(圖6(b))。

由圖6(a)可知，中性紅在-0.4657 V處具有一靈敏的還原峰(圖6(a)曲線1)，當加入DNA后，由于中性紅與DNA的結合導致游離的中性紅濃度降低，中性紅電流隨之降低(圖6(a)曲線2)，繼續加入一定量的蘆丁后，中性紅的峰電流又明顯增強(圖6(a)曲線3)；由圖6(b)熒光圖譜得到了類似的結果。這可能是由于蘆丁與DNA的結合使體系中原來插進DNA雙鏈堿基對中的中性紅分子再次的游離出來，體系中游離的中性紅濃度增加而導致其光電化學信號增強；蘆丁能取代中性紅與DNA產生相互作用，表明蘆丁和中性紅與DNA的相互作用方式及位點相同，進一步表明實驗條件下蘆丁能有效插進DNA雙鏈的堿基對中間與DNA發生嵌插作用的結合。應用電化學實驗數據按照文獻方法[12]計算了蘆丁與DNA的結合數m=1，兩者的結合常數β=3.77×105L/mol。

3 結論

采用循環伏安法和微分脈沖伏安法研究了蘆丁在多壁碳納米管修飾碳糊電極上的電化學行為，在此基礎上研究了蘆丁與DNA的相互作用。實驗發現多壁碳納米管對蘆丁具有明顯催化作用，在pH=3.21的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中蘆丁能產生良好的電化學信號，蘆丁在多壁碳納米管修飾電極上的反應是受吸附控制的2質子，2電子反應過程，在此基礎上研究DNA的加入對蘆丁氧化峰的影響，發現蘆丁能通過嵌入方式與DNA相結合。