膽酸誘導急性肺損傷小鼠模型的建立和評價

孫昂然劉嘉豪陳星君李夢春文成剛高敏胡章雪*

(1.陸軍軍醫大學大坪醫院,重慶 400042;2.96961部隊衛生隊,北京 102206;3.陸軍軍醫大學基礎醫學院生物化學與分子生物教研室,重慶 400038)

胎兒將胎糞污染的羊水誤吸入肺所引起的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是新生兒重癥研究的一個重要問題[1],然而胎糞中的重要成分膽酸,是否在ALI中發揮關鍵作用,尚無直接證據。膽酸作為一種重要的致炎因子[2],主要用于重癥胰腺炎動物模型的構建[3],但能否誘導動物的肺損傷,尚無報道。本實驗旨在利用膽酸構建小鼠的肺損傷模型,為探究膽酸誘發新生兒肺損傷的分子機制提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

54只6～8周C57BL/6清潔級野生型小鼠。雄鼠18只,體重(26.0±1.8)g;雌鼠36只,體重(19.3±2.4)g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司【SCXK(京)2019-0010】。飼喂設施由陸軍特色醫學中心提供【SYXK(軍)2017-0057】,飼養條件:(22±2)℃,晝夜各半循環照明,自由采食飲水,飼養7 d后開始實驗。所有操作均符合陸軍軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會倫理學要求(審批號:AMUWEC 20201510)。

1.1.2 主要試劑與儀器

膽酸(Sigama,CAS:81-25-4);DMSO溶液(Solarbio,CAS:D8371);PBS溶液(Hyclone,CAS:SH30256.01);4%多聚甲醛固定液(碧云天,CAS:P0099);HE染色劑(碧云天,CAS:C0105);鼠TNFαELISA試劑盒(碧云天,CAS:PT512);鼠IL-1β ELISA試劑盒(碧云天,CAS:PI301);血氣分析測試卡片(Abbott Point of Care Inc,CAS:03P88-25)。

小動物X光機(faxitron X-ray,MX-20,美國);手術器械(碧云天);電子天平(北京賽多利斯)。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備

膽酸以DMSO溶解,再用PBS稀釋,使其終濃度為5 mmol/L。

1.2.2 動物分組

按照給藥方法×藥物(3×3)析因設計分組小鼠。給藥方法分為:氣管切開、鼻滴1 d,鼻滴6 d。藥物為膽酸,并且設置其對應的溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組,共9組,每組6只(雌鼠4只,雄鼠2只)。如表1所示。鼻滴給藥處理的頻率為每天1次,其中鼻滴1 d是指鼻滴給藥處理1 d,鼻滴6 d是指鼻滴給藥處理連續6 d,并且兩次鼻滴間隔時間為24 h。

表1 給藥方法×藥物(3×3)析因設計小鼠分組Table 1 Administration method×drug(3×3)factorial design mice group

1.2.3 動物模型制備

氣管切開灌肺模型:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠。待小鼠肌肉松弛,四肢無活動后,充分暴露小鼠氣管,在軟骨間環狀韌帶處用眼科角膜剪剪開直徑約2 mm開口,用微量加樣槍灌注膽酸(0.1 mmol/kg),再推入1 mL空氣,最后縫合。同理分別灌注溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組。

鼻滴膽酸入肺模型:麻醉后,膽酸經鼻滴入小鼠(5μmol/kg)。鼻滴持續時間1～2 min。溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組的動物,其處理方式同膽酸組。

1.2.4 一般體征觀察

處置完成后,小鼠回籠飼養,給予充足的水和飼料,觀察其飲食、活動等一般情況。連續鼻滴6 d的小鼠,每日稱量體重,以粗略判斷其健康狀況。

1.2.5 樣品檢測

(1)胸部X線檢查:小動物X光機參數設置:曝光時間18 s,管電壓26 kV。

(2)血氧分壓檢測:麻醉后,打開小鼠胸腔,用肝素化的1 mL空針在心尖搏動出穿刺抽取0.15 mL血液,將血氣標本注入血氣測試卡片中檢測血氧分壓(blood oxygen partial pressure,PO2)。

(3)觀察肺組織的大體改變:離體肺組織以PBS溶液沖洗后,觀察肺葉出血、水腫情況,組織表面斑塊、顏色并拍照。

(4)觀察肺組織病理學變化:取右肺上葉,經4%多聚甲醛固定、常規石蠟包埋、切片和HE染色,再用光學顯微鏡觀察小鼠肺組織的病理變化。

(5)ELISA法檢測小鼠肺組織中TNF-α和IL-1β的含量:取一部分組織提取蛋白,經ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量。操作嚴格按照試劑說明進行,用酶標儀測定OD值后再計算試劑樣品的濃度。

1.3 統計學分析

將血氧分壓值、TNF-α和IL-1β的含量分別作為計量資料。對血氧分壓結果采取3×3析因設計資料方差分析和單因素方差分析,對TNF-α和IL-1β的含量采取3×3析因設計資料方差分析。P<0.05則表示差異有統計學意義。用SPSS 20.0軟件進行分析,用GraghPad Prism 8.0.1繪制統計分析圖。

2 結果

2.1 一般體征觀察

9組小鼠完成給藥后全部存活。氣管切開膽酸組與其溶劑對照DMSO組,或者與其空白對照PBS組相比,小鼠蜷縮,活動和飲食減少。膽酸鼻滴1 d組與其相應的溶劑對照DMSO組或空白對照PBS組相比,小鼠活動和飲食情況正常。膽酸鼻滴6 d從第4天開始,活動和飲食減少;溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組小鼠,從第5天開始活動和飲食減少。膽酸鼻滴6 d組及其溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組,3組小鼠體重均下降(如圖1所示),但鼻滴結束時,各組間比較,均無顯著性差異(P>0.05),說明3組小鼠營養狀況相似。

圖1 小鼠體重的變化Figure 1 Alteration in mice body weight

2.2 小鼠胸部X線片

氣管切開膽酸組與空白對照PBS組、溶劑對照DMSO組相比,肺紋理增多、肺野透光度降低,呈毛玻璃樣改變,但未見心影增大、支氣管充氣(如表2,圖2 a、b、c所示)。鼻滴1 d除膽酸組中有2例肺紋理增多,其余均未見異常(表2,圖2 d、e、f所示)。鼻滴6 d膽酸組,有3例肺紋理增多,伴有毛玻璃樣改變和散在小斑片樣陰影,溶劑對照DMSO組中,有2例肺紋理增多(如表2,圖2 g、h、i所示)。

圖2 不同處理后小鼠出現肺彌漫性浸潤表現的情況Figure 2 X-ray of diffuse lung infiltration in mice after different treatments

表2 不同處理后小鼠肺出現彌漫性浸潤的例數Table 2 Number of cases of diffuse infiltration of mouse lungs after different treatments

2.3 肺組織大體觀察

氣管切開手術處理的小鼠中,空白對照PBS組的小鼠肺表面未見局灶性出血(圖3a),但是膽酸組和溶劑對照DMSO組中,均可見肺局灶性出血(圖3b、c)。鼻滴1 d處理的小鼠中,膽酸組、溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組均未見肺局灶性出血(如圖3 d、e、f所示)。鼻滴6 d處理的小鼠中,膽酸組、溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組的肺表面均有廣泛出血(如圖3 g、h、i所示)。

圖3 不同處理后小鼠肺大體樣本出血表現的情況Figure 3 Bleeding manifestations of mouse lung gross samples after different treatments

2.4 血氧分壓檢測

以血氧分壓(PO2)作為測量指標進行析因分析。首先分析藥物因素單獨效應,膽酸組顯著低于空白對照組(P<0.001)和溶劑對照組(P<0.05),說明膽酸可以誘導PO2降低(如表3所示)。再分析手術方法(包括氣管切開、鼻滴1 d和鼻滴3 d)的單獨效應,氣管切開組與鼻滴1 d組或者鼻滴6 d組相比,均無統計學差異(P>0.05),但是鼻滴6 d組與鼻滴1 d組相比較,PO2顯著降低(P<0.01),說明較長時間鼻滴(6 d)比短時間鼻滴(1 d)更加影響血氧分壓(如表4所示)。

表3 藥物因素單獨效應各藥物組間PO2比較Table 3 Comparison of PO2 between drug groups in individual effects of drug factors

表4 給藥方法因素單獨效應各藥物組間PO2比較Table 4 Comparison of PO2 between each drug group by factors of administration method alone effect

在析因分析后,對3種給藥方式分別進行單因素方差分析。在氣管切開小鼠中,膽酸組顯著低于空白對照組(P<0.001)和溶劑對照組(P<0.01),說明氣管切開手術條件下再灌注膽酸能有效降低血氧分壓。鼻滴1 d時,膽酸組與其溶劑對照組和空白對照組相比,均無統計學差異(P>0.05),說明鼻滴1 d膽酸不能造成小鼠的肺損傷。鼻滴6 d膽酸組與其溶劑對照組和空白對照組相比,均有降低,但無統計學差異(P>0.05)(如圖4)。

圖4 不同給藥方法分別進行藥物組間比較血氧分壓情況Note.Compared with cholic acid group,**P<0.01,***P<0.001.Figure 4 Compare the blood oxygen partial pressure between the drug groups with the drug groups with the different admistration methods

2.5 肺組織病理觀察

氣管切開手術的3組小鼠中,膽酸組與其溶劑對照DMSO組或空白對照PBS組相比,肺泡腔結構破壞、出血和肺泡壁增厚(如圖5 a、b、c)。鼻滴1 d的3組小鼠中,膽酸組表現為散在的局灶性出血,但肺泡結構和肺內血管并無顯著改變(如圖5 d、e、f所示)。鼻滴6 d的3組小鼠中,膽酸組的肺泡壁有明顯的增厚,肺泡壁破壞嚴重,血管周圍和肺間質的炎細胞浸潤(如圖5 g、h、i所示)。

圖5 不同處理方法對小鼠肺病理學的影響(HE染色)Figure 5 Effects of different treatment methods on lung pathology in mice(HE staining)

2.6 肺組織中TNF-α和IL-1β檢測

以TNF-α和IL-1β作為測量指標進行析因設計。首先分析藥物因素單獨效應,膽酸組TNF-α,IL-1β顯著高于空白對照組(P<0.001)和溶劑對照組(P<0.001)(如表5、6所示)。接著分析給藥方法單獨效應,鼻滴1 d的小鼠,其TNF-α和IL-1β顯著低于氣管切開小鼠(P<0.001)和鼻滴6 d的小鼠(P<0.001),但是氣管切開小鼠和鼻滴6 d小鼠之間無統計學差異(如表7、8)。最后分析給藥方法和藥物是否存在交互作用。由于氣管切開且灌注膽酸的小鼠,其TNF-α含量(138.07±15.02 pg/mL)和IL-1β(232.06±45.89 pg/mL)含量均高于其它各組,析因分析顯示出給藥方法和藥物之間存在交互作用(如圖6所示)。

圖6 給藥方法與藥物之間的交互效應Note.A.TNF-αcontent.B.IL-1βcontent.Figure 6 Interaction between drug delivery method and drug

表5 藥物因素單獨效應各藥物組間TNF-α含量比較Table 5 Comparison of TNF-αcontent among different drug groups in individual effects of drug factors

表6 藥物因素單獨效應各藥物組間IL-1β含量比較Table 6 Comparison of IL-1βcontent among different drug groups in individual effects of drug factors

表8 給藥方法因素單獨效應各藥物組間IL-1β含量比較Table 8 Comparison of IL-1βbetween each drug group by factors of administration method alone effect

3 討論

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種常見的新生兒重癥,而胎兒將胎糞污染的羊水誤吸入肺所造成的ALI可進一步引發嚴重的并發癥,危及胎兒生命。胎糞的成分復雜,包括膽酸、膽酸鹽、膽固醇及其前體、脂質、胰磷脂酶A2、超多糖及蛋白質等[4-5]。膽酸是一種強烈的致炎因子,用于重癥胰腺炎動物模型的構建[3]。模型中膽酸可以引起肺損傷[6],從而提示,如果用膽酸刺激肺,肺表現的炎性損傷可能會與胎兒的胎糞吸入所造成的ALI具有一定的相似性。

根據美國胸科協會對急性肺損傷動物模型的判斷標準,只要具備組織損傷證據、肺泡毛細血管屏障改變的證據、炎癥反應證據和生理功能障礙證據中的至少三項[7-8],即為ALI動物模型造模成功。目前,ALI動物模型主要分為直接和間接損傷兩大類:直接肺損傷模型包括鹽酸吸入模型、脂多糖[9]或油酸[10]注射模型、機械通氣模型[11]以及病毒感染模型等;間接肺損傷模型包括內毒素模型、燒傷/煙霧吸入模型、輸血模型、缺血-再灌注模型及胰腺炎模型等。但是這些模型不能模擬胎兒吸入胎糞引起的ALI。目前未見以膽酸直接刺激肺構建的ALI的模型。如果建立以膽酸灌注入肺誘發急性肺損傷(ALI)的動物模型,則能為探討新生兒胎糞吸入所誘發的急性肺損傷機制奠定基礎。

本實驗把膽酸通過氣管切開、鼻滴1 d和鼻滴6 d的方式給予小鼠。鼻滴法給藥多用于臨床治療,也用于誘發肺炎的相關實驗[12-13]。鼻滴膽酸6 d的小鼠,X胸片、組織病理變化、血氧分壓、炎性因子TNF-α和IL-1β等各項指標都反映出其肺部炎癥比鼻滴膽酸1 d的小鼠更加嚴重,表明重復鼻滴給藥造成的肺損傷更加嚴重。鼻滴膽酸6 d的小鼠相對于其溶劑對照組和空白對照組,胸片、TNF-α和IL-1β的改變不及組織病理的變化,原因可能是小鼠肺損傷炎癥性滲出期在24～48 h[7,13],TNF-3和IL-1β釋放高峰在損傷后2 h和24 h[14],組織病理改變晚于炎癥損傷,但是拍攝胸片和采集肺組織樣本是在鼻滴6 d后,可能錯過了肺部炎性滲出的峰值期和TNF-α和IL-1β釋放的高峰期,故胸片只有輕微的彌散性浸潤,TNF-峰含量膽酸組甚至低于溶劑對照組。如果能夠連續拍攝X胸片和采集肺組織樣本,檢測炎性相關指標,則能提供一個更加合理的給藥時間,有利于構建鼻滴膽酸誘導ALI的動物模型。

鼻滴6 d是連續刺激肺組織造成損傷。鼻滴6 d的3組小鼠,X胸片、大體樣本、血氧分壓指標都發生了明顯的肺損傷,提示6 d的重復鼻滴給藥的方式是造成肺損傷的重要原因。鼻滴引起小鼠的嗆咳,使滴入物進入肺組織引發炎癥反應,即使膽酸有致炎效應,也可能被鼻滴掩蓋,所以鼻滴膽酸組與鼻滴DMSO組或鼻滴PBS組之間,除肺病理組織損傷一項證據,其余各項指標沒有明顯差異,說明鼻滴6 d膽酸不能有效誘導小鼠的ALI模型。如果要采用鼻滴造模,則要調整鼻滴藥物的劑量和時間以取得其他相關實驗證據。

本研究還通過氣管切后再灌注膽酸以誘導形成ALI的動物模型。相較鼻滴滴入,氣管切開后藥物直接抵達肺組織,嗆咳排出的藥物體積較小,可以準確計量灌注劑量。并且,膽酸只作用于肺,不進入消化道,作用器官單一。氣管切開再灌注膽酸的小鼠,其X線胸片、組織病理變化、血氧分壓、TNF-α和IL-1β各項指標,較其溶劑對照組和空白對照均有顯著改變,具備了組織病理、炎癥反應和生理功能障礙這三項實驗證據,證明氣管切開確實能成功誘導ALI,形成膽酸誘導的ALI動物模型。

4 結論

本實驗探討了膽酸誘導小鼠急性肺損傷模型的構建,結果表明,氣管切開灌注膽酸構建急性肺損傷小鼠模型周期短,藥物劑量可控,重復性好,是一種相對可靠的構建方法。該模型的建立將為探究膽酸誘發新生兒肺損傷的分子機制提供基礎和依據。