抑郁對大鼠腸道菌群的影響研究

衛逸君, 張安琪， 邵一帆， 李海北， 陳天姣， 師丹陽， 楊 棟， 李君文， 金 敏

(軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所， 天津 300050)

抑郁癥是一種嚴重影響患者身心健康的精神紊亂疾病，在臨床上可見情緒低落、思維遲緩、行為遲鈍、意志消沉、悲痛欲絕，嚴重者會產生自殺傾向或伴隨妄想等精神病性癥狀〔1〕。抑郁癥已成為全球性健康難題，其發病率逐年增加，全世界總患病人數約達四億〔2〕。此外，因為傳染病等非精神類疾病的發展過程中常常伴隨精神類疾病，所以抑郁癥等精神類疾病也能夠增加非精神類疾病的發病率〔3〕。 腸道菌群是腸道微生態系統的重要組成部分，廣泛參與各種生理活動，正常菌群有助于機體維持神經、內分泌、免疫等功能〔4-5〕。大量研究表明大腦和腸道之間存在著雙向通訊系統，腸道微生態通過“微生物-腦-腸軸”作用于中樞系統〔6〕。因此，腸道菌群的改變與多種生理和精神疾病密切相關。抑郁等不良情緒能夠通過應激反應改變腸道通透性、破壞腸粘膜屏障并激活其免疫機制，從而導致腸道菌群結構紊亂〔7〕。相應地，通過補充腸道益生菌等方法調節腸道菌群可以有效改善抑郁癥狀〔8〕。本研究以大鼠為研究對象，通過構建受不可預知性慢性應激的抑郁大鼠模型，觀察抑郁前后腸道菌群的變化，為揭示抑郁癥的發展機制奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級雄性Wistar大鼠16只，體重(150±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供〔批號：SCXK(京)2016-0006〕。大鼠飼養場所為SPF級動物房，實驗過程保證室溫23-25 ℃，相對濕度40-60%，晝夜明暗交替12 h，大鼠自由進食和飲水。

1.2 主要儀器電子天平(上海津平科學儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(Sigma-Aldrich上海貿易有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海滬西分析儀器廠)；高純水裝置(Millipore，衛生裝備研究所)；Qubit2.0熒光儀(美國Thermo公司)。

1.3 主要試劑蔗糖、生理鹽水溶液、75%乙醇(天津市大茂化學試劑廠)。

2 方法

2.1 抑郁大鼠的獲得實驗初期，按照糖水基線測試結果將16只大鼠隨機分為對照組和應激組，每組各8只，每兩只一籠進行飼養。應激組接受不可預知性慢性應激(unpredictable chronic stress, CUS)，對照組不接受任何應激，同時確保對照組飼養于和應激組相同的環境但不受到應激過程產生的聲音和氣味影響。應激因素包括短時項目(包括束縛、空瓶刺激、夾尾、熱水游泳以及冷水游泳)和長時項目(禁水、禁食、傾斜45度、潮濕100 ml、無墊料、徹夜照明以及頻閃)。每天隨機給予應激組大鼠短時項目和長時項目各一種，持續28天。實驗第4周時，應激組大鼠的糖水偏好率出現明顯下降(從70%下降到43%)，確定獲得抑郁大鼠。

2.2 糖水偏好實驗快感缺失是抑郁的重要癥狀，而糖水偏好率降低能有效反映嚙齒動物出現快感缺失。待大鼠禁水禁食14小時后，進行糖水偏好測試，單籠飼養，每個籠子分別放置1%的蔗糖水和普通水各一瓶一小時，期間30分鐘交換兩水瓶的位置以避免位置依賴性產生的干擾。1h后通過稱量兩水瓶重量變化計算糖水偏好率。 糖水偏好率(%)=糖水飲用量/(糖水飲用量+普通水飲用量)。

2.3 大鼠腸道微生物分析獲得抑郁大鼠模型后，將大鼠單籠放置于滅菌空籠，待其產出糞便，迅速裝入滅菌凍存管于液氮中速凍，并轉移至-80℃冰箱保存。隨后，將大鼠糞便樣本送至Illumina NovaSeq PE250平臺進行16s rDNA測序。

3 結果

3.1 菌群結構分析應激組和對照組大鼠的大腸菌群構成存在差異，兩組共有955個OTU，相對于對照組(170個OUT)，應激組(71個OUT)的獨有成分較少。主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis, PCoA)采用線性模型，樣品間的距離越近表示它們的腸道菌群構成相似度越高。二維分析圖(圖1A)顯示，應激組腸道微生物的群落結構相似，聚集在中間區域，而對照組聚集在右下角區域，兩者有明顯區分。 Anoism分析可用于組間差異顯著性檢驗，來判斷組間差異是否大于組內差異。Anoism分析結果(圖1B)顯示，R=0.463(P=0.001)，說明應激組和對照組的組間差異大于組內差異，兩組組間差異具有極顯著性。主坐標分析和Anoism分析均說明應激組和對照組大鼠的菌群結構之間存在差異。

圖1 菌群結構分析(A)主坐標分析；(B)Anoism分析

3.2 物種多樣性分析通過檢驗應激組和對照組α多樣性的六種指數(observed species指數、shannon指數、simpson指數、chaol指數、ACE指數、PD whole tree指數)，可以描述測序結果單個樣品多樣性，并進行組間差異分析。從圖2可以看出，應激組六種指數均低于對照組，其中，除shannon指數和simpson指數外，兩組其余四個指數的差異均有統計學意義(P<0.05)。所以，綜合結果表明應激組的物種多樣性低于對照組。

圖2 六種指數的組間差異分析與對照組比較:*P<0.05

3.3 物種組成分析門水平上的物種相對豐度圖(圖3A)顯示，在所有樣品中，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和柔壁菌門(Tenericutes)為優勢菌，總占比達98.79%，其中厚壁菌門(Firmicutes)為最明顯的優勢菌(81.82%)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和柔壁菌門(Tenericutes)分別占9.44%和7.52%。此外，與對照組相比，應激組大鼠腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)和柔壁菌門(Tenericutes)相對豐度較高，擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度較低。根據物種豐度選取排名前10的物種，并做其與樣品的聚類熱圖，由此得到的聚類熱圖可以直觀看出在兩組中哪些物種豐度較高。 物種豐度聚類熱圖(圖3B)顯示，除三種優勢菌外，應激組大鼠腸道菌群中放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和無法確定的分類的細菌(unidentified Bacteria)的相對豐度高于對照組，變形菌門(Proteobateria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)和廣古菌門(Euryarchaeota)相對豐度較低。物種相對豐度圖和聚類熱圖均說明應激組和對照組大鼠腸道菌群物種組成存在顯著差異。

圖3 物種組成分析(A)物種相對豐度圖；(B)聚類熱圖

4 討論

腸道菌群種類繁多，數量巨大，人體自身細胞數量僅為腸道細菌數量的十分之一。腸道菌群在生理狀態下維持穩態，參與營養物質吸收、維生素和氨基酸的合成、能量供應、消化道免疫、藥物和毒物的代謝、腸道生物屏障等多項生理功能〔9〕。當腸道穩態被一系列內外因素打破，例如宿主的生理發育狀態、生活習慣和飲食結構等改變，腸道菌群的生存環境會產生變化，其構成和功能也會發生改變，從而引起各種菌群失調癥狀。研究證明，機體和腸道微生物及其代謝產物通過神經、內分泌和免疫途徑相互調節，從而維持腸道微生態平衡〔10〕。 此外，“微生物-腦-腸軸”學說已經得到了分子生物學方面的證實〔11〕。腸道菌群失衡會引起2型糖尿病、腸炎、癌癥和抑郁等各種疾病，對人類健康有很大影響〔12-13〕。腸道菌群的組成與抑郁之間存在密切關聯。Davis等人〔14〕發現瘤胃球菌種豐度的增加與小鼠抑郁樣行為(如快感缺乏)的增加有關。研究表明，與正常受試者相比，重度抑郁癥患者的腸道菌群中，Eggerthella、Holdemania和Gelria等菌屬顯著增加，而Prevotella和Dialister菌屬顯著減少〔15〕。同時，重癥抑郁癥患者的抑郁行為和生理特征會隨著其腸道菌群的移植而轉移〔16〕。

本研究選取的CUS模型利用長期且不可預知的刺激引發動物抑郁行為，其機制接近人類抑郁癥〔17〕。經CUS造模后，大鼠的糖水偏好率顯著下降說明其出現快感缺失癥狀，抑郁大鼠模型建立成功。隨后，采取16S rDNA測序的方法分析抑郁大鼠腸道菌群的變化。首先進行了主坐標分析和Anoism分析，證明了抑郁大鼠和正常大鼠的菌群結構之間存在差異。其次，α多樣性分析說明了抑郁大鼠腸道菌群的物種多樣性低于正常大鼠。與之類似，研究證明，腸炎等腸道疾病會導致腸道菌群物種多樣性顯著降低〔12〕。第三，通過物種組成分析發現，抑郁大鼠腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)和柔壁菌門(Tenericutes)的相對豐度較高，擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度較低。許多研究證明擬桿菌門(Bacteroidetes)作為腸道菌群中的優勢菌群，與抑郁癥存在密切關聯〔18〕。本研究發現厚壁菌門(Firmicutes)的增加和擬桿菌門(Bacteroidetes)的減少與抑郁的發生有關，這與一項重癥抑郁患者腸道菌群的研究結果一致〔19〕。

腸道菌群作用于中樞及周圍神經系統，通過多種直接或間接的方式調控神經遞質，導致宿主精神行為改變，從而引發或加重抑郁。腸道微生物的代謝產物作為神經遞質或者其前體作用在腸道上皮細胞上，調節腸道上皮細胞的內分泌或旁分泌功能。同時，腸道菌群的的變化會引起腸腔局部環境的改變，腸道的淋巴細胞感受到變化后釋放細胞因子進入中樞神經系統發揮調節作用〔8〕。此外，腸道內分泌細胞釋放的腸肽可以刺激感覺神經元末梢，從而產生一系列神經沖動進入大腦〔20〕。

腸道菌群廣泛參與調控人體多種生理功能，影響人體身心健康，本研究以抑郁大鼠為模型，研究其腸道菌群變化，發現抑郁大鼠腸道微生態紊亂，菌群失調，物種多樣性顯著降低，為基于腸道菌群研究抑郁的發展機制奠定重要基礎。