黑龍江省主栽紅小豆品種蛋白質功能性質分析

沈鑫婷 許馨予 楊鵠雋 賈 斌,3 張慧敏,3 左 鋒

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319)(黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319)(糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心3，大慶 163319)

紅小豆，又名赤豆，種子暗紅色，長圓形，原產于中國，有2 000多年栽培歷史[1]。在我國南北都有種植，其中黑龍江種植面積及產量均最大，約占全國的50%[2]。紅小豆富含多種活性成分，其中蛋白質質量分數21%～23%[3]，并且其氨基酸組成較為豐富，其必需氨基酸含量高于FAO/WHO標準，因此具有較高營養價值，被作為食品加工的優質原料[4,5]。同時，紅豆的功能價值也很高[6,7]。

隨著人們對健康飲食的需求，對紅小豆營養價值及功能特性的研究也日益深入。Liu等[8]利用酶法提取紅小豆蛋白，提取率最高可達73.34%，其中球蛋白占紅豆總蛋白含量的一半以上，說明紅小豆蛋白是一種成本低且功能性質良好的蛋白質。任傳英等[9]對紅小豆進行成分及抗氧化活性分析，結果表明其總酚、總黃酮含量分別為2.48、4.03 mg/g，DPPH清除率達85%，總抗氧化能力為529.47單位/g，具有明顯的抗氧化能力。Meng等[10]對紅小豆蛋白進行結構和功能性質分析結果表明：紅小豆蛋白富含有一定α-螺旋和β-轉角結構，與商業大豆相比，紅小豆蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩定性更強，并且由于其疏水性較弱，還具有較低的水化能力和較強的脂肪結合能力。張波等[11]將紅小豆蛋白質與大豆蛋白做對比，在不同pH條件下紅小豆蛋白溶解度明顯優于大豆蛋白，且其乳化穩定性、起泡性均高于大豆蛋白，最低凝膠點也更低。

為深入了解黑龍江主栽品種紅小豆蛋白質功能特性，本研究以黑龍江主栽紅小豆品種狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅為研究對象，利用熒光及紫外分光光度法對其溶解性、乳化性、起泡性等功能特性進行研究，以期為紅小豆等雜糧作物的產品開發和精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅小豆：狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅；花生油。鹽酸、氫氧化鈉、Tris-Gly試劑、Ellman試劑、巰基乙醇、8-苯胺基-1-荼磺酸(ANS)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、氯化鈉：分析純。

1.2 儀器與設備

Scientz-10N冷凍干燥機，K9540凱氏定氮儀，UV2450紫外可見分光光度計，LS-55熒光分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅小豆蛋白的制備

參考尹秀蓮等[12]方法，稍作改動。將5種紅小豆洗凈烘干，粉碎過篩。磨粉后按照1∶5的比例溶于石油醚攪拌5 h，旋蒸，按照1∶20比例加入去離子水，用1 mol/L NaOH調節pH至9，攪拌時間2 h，3 500 r/min離心25 min，取上清液，再用1 mol/L HCl調節pH至4.0，靜置1 h，3 500 r/min離心25 min，取沉淀冷凍干燥。

1.3.2 紅小豆蛋白質功能性質測定

1.3.2.1 溶解性測定

參考馮玉超等[13]方法，利用凱氏定氮法測定樣品總蛋白含量，記為m2，再配制濃度為10 g/100 mL的蛋白質溶液，用HCl和NaOH分別調pH，室溫下攪拌1 h，離心，取上清液，以牛血清蛋白為標準品，用福林-酚法測定蛋白質含量，記為m1，計算NSI。

1.3.2.2 表面游離巰基及總巰基含量測定

配制50 g/L蛋白質溶液，離心后取2 mL上清液，加入5 mL Tris-Gly和0.1 mL Ellman試劑，混勻后室溫靜置15 min，在412 nm處測其吸光度，記為A，稀釋倍數記為D。計算得出表面巰基含量[14]。

取2 mL上清液，加入5 mL tris-Gly-8MUrea-0.5%緩沖液和0.1 mL Ellman試劑，重復1.3.2.2步驟，計算得到總巰基含量。

1.3.2.3 表面疏水性測定

采用ANS為探針，利用磷酸鹽緩沖液配制成不同濃度蛋白質溶液，離心，取2 mL上清液，設定激發波長390 nm，發射波長470 nm，夾縫寬度5 nm，測定熒光強度，記為FI0；另取2 mL上清液，加入10 μL 8 mmol/L ANS，室溫靜置1 h，測定熒光強度，記為FI1。以蛋白質濃度為橫坐標，FI0為縱坐標做圖，表面疏水性指數為曲線初始階段的斜率，記為S0[15]。

FI0=FI1-FI2

1.3.2.4 起泡性及起泡穩定性測定

取5 mL紅小豆蛋白溶液，高速分散器攪打2 min，總體積記為V1，泡沫體積記為V2，靜置，記錄泡沫體積，記為V3[16]。

1.3.2.5 乳化性及乳化穩定性測定

配制不同濃度蛋白質溶液，加入15 mL花生油，高速分散器攪打5 min。取100 μL均質后的試液，用質量分數為0.1%的SDS稀釋50倍，500 nm處測其吸光值，記為A1，一段時間后重復測定，記為A2[17,18]。

EA=A1×50

1.3.2.6 吸水性及吸油性測定

配制不同濃度蛋白質溶液，每5 min震蕩1次，30 min后離心，將帶有沉淀的離心管烘干至恒重。樣品質量記為m，離心管質量記為m1，烘干后的離心管質量記為m2。

配制不同比例樣品和油于離心管中，靜置30 min，離心，吸去上層液層，再將離心管倒置，吸除流出的油脂。離心管質量記為m3，總質量記為m4。

1.3.2.7 最低凝膠點測定

取不同質量樣品溶于0.1 mol/L NaCl溶液中，磁力攪拌器攪拌30 min，調pH至7.0，90 ℃水浴加熱30 min，冷藏24 h，觀察凝膠情況。

1.3.3 統計分析

2 結果分析

2.1 蛋白質含量

由表1可知，5個紅小豆品種的蛋白質質量分數為18.34%～24.03%。其中品鑒紅蛋白質含量較高，為24.36%±0.02%；寶清紅蛋白質含量最低，為19.32%±0.05%。

表1 5種紅小豆蛋白質質量分數

2.2 溶解性分析

5種紅小豆蛋白質在不同pH條件下的溶解性如圖1所示。由圖1可知，當pH=4.0時，5種紅小豆蛋白質溶解性均達到最小值，其中農墾紅二號溶解度最小，為19.4%；農安紅溶解度最大，為22.79%，說明其等電點在4.0左右。當pH>4時，紅小豆蛋白質溶解度逐漸升高，農安紅在pH=10條件下溶解度可達58.99%，與大豆蛋白溶解度相似[19]。

2.3 表面游離巰基及總巰基含量分析

蛋白質通過巰基與二硫鍵相互轉化在人體內發揮作用，巰基影響蛋白質構象、活性與功能[20]。狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅紅小豆蛋白質游離巰基及總巰基含量如表2所示。表2可知，5種紅小豆蛋白質游離巰基及總巰基含量分別為26.3～33.4 μmol/g、42.3～61.6 μmol/g。其中寶清紅游離巰基及總巰基含量最高為(33.4 ±5.6) μmol/g和(61.6±3.2) μmol/g且與其他品種有顯著差異(P<0.05)，狀元紅游離巰基及總巰基含量均最低，為(26.3±1.7) μmol/g和(42.3±1.3) μmol/g。游離巰基與總巰基的含量是由是由分子間作用力決定的，當蛋白中可溶性小分子發生聚集，巰基包埋會使游離巰基及總巰基含量較低，這也說明狀元紅蛋白分子的聚集程度較高[21]。

2.4 表面疏水性分析

狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅紅小豆蛋白質疏水性指數如表3所示。由表3可知，5種紅小豆疏水性指數為185.6～425.5，均有顯著差異(P<0.05)，其中農墾紅二號疏水性指數最大為425.5±0.5，農安紅疏水性指數最小為185.6±1.4。

一般來說，在一定條件下蛋白質的表面疏水性與親水性呈負相關，即蛋白質疏水性越強，其溶解度則越小[22]，因此可知農墾紅二號溶解度最小，農安紅溶解度最大，這與2.1中溶解度的測定結果相符。

表3 5種紅小豆蛋白質疏水性指數

2.5 起泡性及起泡穩定性分析

狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅紅小豆蛋白質的起泡性及起泡穩定性如圖2、表4所示。如圖2所示，當溶液濃度小于6 g/100 mL時，5種紅小豆蛋白質起泡性隨濃度升高大幅度升高，當溶液濃度達到6 g/100 mL時，5種紅小豆蛋白質起泡性均達到最大，其中狀元紅起泡性最強可達27.64%，農墾紅二號起泡性最弱為22.41%。當溶液濃度繼續升高時，起泡性略有降低，這是因為當蛋白濃度達到一定值時，表面形成較厚的吸附膜，不再產生泡沫。

如表4所示，隨蛋白質濃度升高，5種紅小豆蛋白質起泡穩定性也升高；隨靜置時間增長，起泡穩定性減弱。其中狀元紅最為穩定，當蛋白質質量濃度為10 g/100 mL，靜置10 min后，其起泡穩定性為84.4%；靜置60 min后，起泡穩定性為54.6%，結果略高于蕓豆[23]。

2.6 乳化性及乳化穩定性分析

狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅紅小豆蛋白質乳化性及乳化穩定性如圖3、圖4所示。

由圖3可知，紅小豆乳化性隨蛋白質濃度增大而增大，溫青玉等[24]研究也發現蛋白質溶液濃度增大會使體系界面的膜增厚，同時提升膜的強度，乳化性也隨之增大。5種紅小豆中，農墾紅二號乳化性最強，農安紅乳化性相對較弱，農墾紅二號的乳化性測定結果與2.3中表面疏水性測定結果呈現出一定的相關性，He等[25]通過研究菜豆蛋白也發現蛋白質疏水性與乳化性呈一定的正相關關系，此外，由圖4可知，乳化穩定性同樣隨蛋白質溶液濃度增大而增大，其中農墾紅二號乳化穩定性最強可達到65%。

圖1 5種紅小豆蛋白質溶解性

圖2 5種紅小豆蛋白質起泡性

圖3 5種紅小豆蛋白質乳化性

圖4 5種紅小豆蛋白質乳化穩定性

圖5 5種紅小豆蛋白質吸水性

圖6 5種紅小豆蛋白質吸油性

表4 5種紅小豆蛋白質起泡穩定性

2.7 吸水性及吸油性分析

狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅紅小豆蛋白質吸水性及吸油性如圖5、圖6所示。由圖5可知，隨著蛋白質溶液濃度升高，5種紅小豆吸水性均緩慢升高，其中農安紅吸水性最強，當溶液質量濃度為10 g/100 mL時，吸水性為2.04%，這是因為溶液濃度增大，蛋白分子中極性基團增多，吸水性也隨之增強。由圖6可知，隨著油的占比增大，5種紅小豆的吸油能力也逐漸增強，這是因為增加油的占比后使其與蛋白質疏水基團作用增多，增大其溶解度，同時增強了吸油能力。與2.3中表面疏水性和2.5中乳化性結果比較，農墾紅二號表面疏水性、乳化性及吸油性均較強，而吸水性和溶解度較低；農安紅表面疏水性、乳化性及吸油性較弱，而吸水性和溶解度較高，變化趨勢與江帆等[26]對黑豆蛋白質的表面疏水性、乳化性等性質研究結果一致。

2.8 最低凝膠點分析

狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、農安紅、寶清紅紅小豆蛋白質的凝膠形成情況如表5所示。蛋白質溶液濃度升高會使其在水中產生的相互作用力增大，當溶液濃度增大到某一點，使排斥力小于吸引力就可形成有空隙的立體網狀結構從而形成凝膠[27]。由表4可知，5種紅小豆蛋白質的最低凝膠點為10～13 g/100 mL，其中狀元紅和品鑒紅凝膠點較高，蛋白質質量濃度為13 g/100 mL時形成凝膠；寶清紅和農墾紅二號凝膠點較低，蛋白質質量濃度為11 g/100 mL就可以形成凝膠。從表2可知：寶清紅和農墾紅二號的蛋白質游離巰基及總巰基含量也較高，更多的巰基暴露在蛋白質表面，凝膠過程中更容易形成二硫鍵，這可能使兩種紅小豆蛋白質的最低凝膠點也較低。

表5 5種紅小豆蛋白質最低凝膠點

3 結論

通過對農安紅、狀元紅、農墾紅二號、品鑒紅、寶清紅等5種紅小豆蛋白質功能性質進行了研究得出：5種紅小豆中品鑒紅蛋白質質量分數最高為24.36%±0.02%，并且與其他品質差異顯著，在pH 4.0左右時5種紅小豆蛋白溶解度達到最低值，其中農墾紅二號溶解度最小為19.4%，農安紅溶解度最大為22.79%；5種紅小豆蛋白質游離巰基、總巰基含量及表面疏水性存在顯著差異(P<0.05)，寶清紅游離巰基及總巰基含量最高為33.4 μmol/g和61.6 μmol/g，農墾紅二號疏水性指數最大為425.5；蛋白的表面疏水性、乳化性及乳化穩定性、吸水性和吸油性之間存在一定相關性，其中農墾紅二號表面疏水性、乳化性及吸油性均最強，而吸水性和溶解度較低；農安紅表面疏水性、乳化性及吸油性最弱，而吸水性和溶解度較高；5種紅小豆蛋白質最低凝膠點存在差異，其中寶清紅和農墾紅二號凝膠點較低，在蛋白質質量濃度為11 g/100 mL就可以形成凝膠。