免疫佐劑MF59穩定性的優化及其局部免疫調節效果比較

鳳羽齡，郭 偉，湛孝東，周萍萍，姜玉新，唐小牛

(1.皖南醫學院 基礎醫學院，安徽 蕪湖 241002；2.嘉興學院 醫學院，浙江 嘉興 314001)

MF59是一種由角鯊烯、司盤85、Tween 80和檸檬酸緩沖液按一定比例乳化而成的水包油乳化劑，顆粒直徑約為160 nm，安全無毒且可完全降解[1]，是目前歐盟批準用于人體的佐劑，已廣泛應用于流感、乙肝、結核病、皰疹病毒疫苗及腫瘤疫苗的制備[2]。

與傳統佐劑(如氫氧化鋁等)相比，MF59偏向于更加溫和的方式增強免疫應答[3]，即Th1/Th2免疫應答的相對平衡。研究表明，單獨應用MF59為佐劑可誘導Th2方向偏移的免疫應答[4-5]，但和Toll樣受體激動劑(如CpG)配伍使用，可誘導Th1方向偏移的免疫應答[6]，單獨應用MF59佐劑，也可誘導Th1方向偏移的免疫應答[7-8]，相同的佐劑為何會產生不同的免疫應答類型，影響免疫應答類型的主要因素是什么，有關此類問題的研究鮮有報道。本研究發現，不同勻漿速度下制備出的MF59的物理性狀及其局部免疫調節效果均存在差異，現將結果報道如下，旨在為提高MF59的免疫學應用效果提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性BALB/c小鼠，7周齡，購于揚州大學比較醫學中心。

1.2 材料 IgE、IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒購于Cloud-clone公司；角鯊烯、司盤85、Tween 80、卵清蛋白(OVA)和臺盼藍均購于SIGMA公司；其他試劑均為國產分析純。XHF-D型高速勻漿機及JY92-ⅡDN型超聲乳化儀購自寧波新芝生物有限公司，ELx800型酶標儀購自美國伯爵公司，22R型臺式高速冷凍離心機購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 佐劑MF59的制備 按如下體積比配制MF59：角鯊烯(4.3%)、司盤85(0.5%)、Tween 80(0.5%)、10 nmol/L檸檬酸緩沖液(94.7%)，并均分為6份。分別經不同轉速的高速勻漿機(5 000 r/min、10 000 r/min、15 000 r/min、20 000 r/min、25 000 r/min)攪拌30 min及超聲乳化(2 000W功率，5s工作，5s間隔)30 min；上述操作均在無菌、冰浴中進行。操作完成后離心(6 000 r/min，5 min)，置顯微鏡下觀察，Motic圖像分析軟件拍照并測量MF59顆粒大小，之后靜置于4℃冰箱，觀察其穩定性。

1.4 注射液的配制 檢測MF59佐劑對抗體及細胞因子影響使用的注射液：MF59乳化劑與100 μg/mL的卵清蛋白水溶液按1∶1體積比進行混合；檢測巨噬細胞募集情況使用的注射液：上述注射液中加入臺盼藍，充分混勻，配成臺盼藍濃度為0.04 g/mL的混合液。

1.5 注射部位IgE抗體、IFN-γ、IL-4含量檢測 60只小鼠隨機分成6組(n=10)，即5 000 r/min組、10 000 r/min組、15 000 r/min組、20 000 r/min組、25 000 r/min組和超聲乳化組；將各MF59分別在相應組小鼠左、右后肢腹股溝行皮下免疫，每鼠200μL；注射后第3天處死小鼠并取注射部位皮膚及肌肉組織，清洗去血，勻漿后7 000 r/min離心5min，取上清，ELISA法檢測注射部位附近皮膚及肌肉組織總IgE抗體、IFN-γ及IL-4含量，操作按試劑盒說明書步驟進行。

1.6 注射部位巨噬細胞招募 30只小鼠隨機分成6組(n=5)，將各MF59分別注射相應組小鼠右后肢，皮下免疫(含10 μg OVA和0.4%的臺盼藍)，每鼠100 μL；同時設PBS組(n=5)，同樣的注射方式和部位，用100μL PBS代替，注射后第3天取注射部位皮膚及肌肉組織，參考相關文獻[9]，制備組織切片，觀察巨噬細胞局部募集情況，并在各組織層次中隨機挑選5張切片，每張切片隨機選取2個視野，計數并比較各組之間的差異。

2 結果

2.1 不同條件下制備的MF59物理學性狀穩定性 經不同轉速的高速勻漿機處理后的MF59，離心均未出現分層現象；顯微鏡下觀察見不同轉速(5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 r/min)勻漿及超聲乳化制備的MF59顆粒的直徑分別為：<16.5、<10.2、<5.6、<1.3、<0.5和<0.38 μm；經高速勻漿機處理后的MF59顆粒均勻度以25 000 r/min組為最佳，但略差于超聲乳化(圖1)；靜置24 h后各組MF59外觀無改變，靜置30 d后，5 000 r/min和10 000 r/min條件下制備的MF59的底層出現明顯的澄清現象，但未出現分層，其他條件下制備的MF59的外觀無明顯改變(圖1)。

1～6分別為超聲乳化、5 000 r/min、10 000 r/min、15 000 r/min、20 000 r/min、25 000 r/min條件下制備的MF59。

2.2 不同勻漿速度條件下制備MF59對注射部位IgE、IFN-γ、IL-4水平的影響 結果顯示，超聲乳化組及25 000 r/min組IgE抗體水平表達均高于5 000～20 000 r/min組(P<0.05)，20 000 r/min組IgE抗體水平表達均高于5 000～15 000 r/min組(P<0.05)，其他組間IgE抗體水平表達差異均無統計學意義(P>0.05)。10 000 r/min組IFN-γ水平表達均高于超聲乳化組、5 000 r/min組、15 000～25 000 r/min組(P<0.05)，5 000 r/min組及15 000 r/min組IFN-γ水平表達均高于超聲乳化組、20 000 r/min組及25 000 r/min組(P<0.05)，其他組間IFN-γ水平表達差異均無統計學意義(P>0.05)。超聲乳化組IL-4水平表達均高于5 000～25 000 r/min組(P<0.05)，25 000 r/min組IL-4水平表達均高于5 000～20 000 r/min組(P<0.05)，20 000 r/min組IL-4水平表達均高于5 000～15 000 r/min組(P<0.05)，15 000 r/min組IL-4水平表達高于10 000 r/min組(P<0.05)，其他組間IL-4水平表達差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同條件下制備MF59對注射部位IgE、IFN-γ、IL-4水平的影響

2.3 不同勻漿速度條件下制備的MF59對注射部位巨噬細胞募集的影響 病理切片觀察結果顯示，PBS組、5 000 r/min組及10 000 r/min組的皮膚、皮下及肌肉組織中均未觀察到巨噬細胞。15 000、20 000、25 000 r/min組和超聲乳化組僅在皮下組織切片中觀察到巨噬細胞，而皮膚及肌肉組織切片中未觀察到(見圖2)。其中單個視野中的巨噬細胞數量25 000 r/min組[(7.20±2.53)個/視野]高于20 000 r/min組[(4.00±1.76)個/視野]及15 000 r/min組[(1.50±1.08)個/視野](P<0.05)，但均低于超聲乳化組單個視野中的巨噬細胞數量[(16.10±5.30)個/視野](P<0.05)。

A.PBS組;B.5 000 r/min組;C.10 000 r/min組;D.15 000 r/min組;E.20 000 r/min組;F.25 000 r/min組;G.超聲乳化組。n=5，F=20.976，P=0.000。

3 討論

MF59通常采用超聲乳化的方法制備[10]，本研究發現，在單位時間內不同功率的超聲乳化制備的MF59顆粒大小無顯著差異，不同轉速勻漿的方法可生成不同的顆粒大小，而分子的理化性質是影響免疫應答的因素之一[11]，為驗證不同顆粒大小的MF59對其免疫學效應影響，我們檢測了Th1、Th2細胞分泌的主要細胞因子IFN-γ和IL-4含量。動物實驗結果表明，5 000～15 000 r/min制備的MF59顆粒較大，在局部可減少IgE抗體及IL-4的生成，而IFN-γ的分泌則增多，說明大顆粒的MF59易誘導Th1方向的免疫應答，而>20 000 r/min及超聲乳化制備的小顆粒MF59則易誘導Th2方向的免疫應答。因此我們推測，MF59顆粒的大小是影響Th1/Th2免疫應答偏移的因素之一。產生此結果可能的原因是：MF59能有效攝取抗原并轉運至引流區淋巴結[12]，大顆粒的MF59表面積及表面張力較小顆粒的MF59大，可攝取較多的卵清蛋白至淋巴結，從而減少抗原在外周血中的濃度，減少其產生過敏反應的概率及IgE抗體含量，即大顆粒MF59不易誘導Th2型免疫應答。同時值得注意的是，5 000 r/min和10 000 r/min條件下制備的大顆粒的MF59穩定性欠佳，因此在研究時應現配現用。

有研究發現，MF59發揮免疫學活性的關鍵機制有：①MF59在注射局部具備瞬時免疫活性，可誘導形成免疫活性環境[5，13]。②誘導內源性ATP瞬時釋放，并在注射局部迅速募集巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、抗原提呈細胞、樹突狀細胞等免疫細胞[12]。③作用于巨噬細胞和粒細胞，促進趨化因子的分泌，促進免疫細胞遷移到注射局部；同時利于抗原提呈細胞攝取抗原，并輸送至引流區淋巴結，啟動獲得性免疫應答[13]等。本研究在檢測不同勻漿速度下制備的MF59在注射局部募集巨噬細胞的能力時，PBS組、5 000 r/min組及10 000 r/min組的各組織切片中均未觀察到巨噬細胞，可能由于檢測技術的局限性，并不代表上述3組完全沒有募集巨噬細胞的能力；15 000～25 000 r/min組和超聲乳化組僅在皮下組織切片中觀察到巨噬細胞，且募集巨噬細胞的能力隨著顆粒直徑的減小而增加，其中超聲乳化組募集巨噬細胞數量最多，說明顆粒大小影響其招募巨噬細胞的能力。造成此結果可能的原因是：小顆粒的MF59在皮下吸收、轉運及擴散的能力強于大顆粒，增大擴散面積的同時增加了被巨噬細胞捕捉到的機會。有研究發現[14]，應用MF59為佐劑進行皮下免疫，注射后24 h利用流式細胞術檢測到注射部位肌肉組織中巨噬細胞含量顯著增高；而本研究中未檢測到，這可能是檢測技術的靈敏度不同造成的。

綜上所述，本研究發現不同勻漿速度下制備的MF59可能會改變Th1/Th2免疫應答偏移，總體上呈現較低轉速勻漿制備的大顆粒MF59易于誘導Th1免疫應答偏移，而高轉速勻漿或超聲乳化制備的小顆粒MF59易于誘導Th2免疫應答偏移，但大顆粒的MF59募集巨噬細胞的能力弱于小顆粒且穩定性欠佳。因此，我們在實驗研究中，可根據不同疫苗免疫保護的具體需要，使用不同顆粒大小的MF59為佐劑，實現定向誘導Th1/Th2免疫應答的偏移，從而加強疫苗免疫保護效果。