牙鲆gnrh基因的表達分析

彭壯壯 ， 鄒玉霞， 劉 琰， 梁少帥， 王雯祥， ， 王麗娟， 鄒聰聰， ，周 順 尤 鋒

(1. 青島農業大學， 山東 青島 266071； 2. 中國科學院海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室 海洋大科學中心， 山東 青島 266071； 3. 中國科學院大學， 北京 100049)

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone， GnRH)是下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic pituitary gonadal， HPG)軸的關鍵上游信號分子。哺乳動物中GnRH通過門靜脈作用于垂體[1]， 而大多數硬骨魚中， GnRH由下丘腦合成并以神經分泌的方式釋放到垂體， 促進垂體促性腺激素(gonadotrophin， GTH)的合成和釋放， 后者可以刺激性腺合成性類固醇激素， 從而調控魚類性腺分化、發育及生殖等過程[2]。

自20世紀70年代 Bmrgus和Matsuo在哺乳動物中發現GnRH以來， 共報道了25種gnrh， 在魚類中鑒定出19種， 其中17種為魚類特有[3]?；谙到y發育樹分析、胚胎起源和腦中神經元的分布， 可將所有gnrh分為gnrh1(sbgnrh)、gnrh2(cgnrh-Ⅱ)和gnrh3(sgnrh)三種類型[4-5]。一般認為， 在魚類中，gnrh1具有神經遞質活性， 是調節垂體促性腺激素的主要類型， 參與魚類繁殖相關的功能[2]；gnrh2與生殖行為的調節和攝食行為調節有關[6]；gnrh3除了與性腺分化和發育等繁殖功能相關外， 還與魚類的感覺功能相關[3]。大多數魚類的腦中同時表達2種或3種gnrh[7-12]。GnRH與魚類性腺發育、性成熟及生殖相關的研究有一些報道[13-15]， 后來發現gnrh1、gnrh2和gnrh3分別在黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)、黃鱔(Monopterus albus)和歐鱸(Dicentrarchus labraxL.)性腺分化期腦和性腺中表達， 在歐鱸中也有明顯性別二態性[11-12，16]， 這些研究提示GnRH在一些魚類的性腺分化中發揮作用。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)、牙鲆屬(Paralichthys)， 是我國具有重要經濟價值的海水養殖魚種。牙鲆雌性生長顯著快于雄性[17]， 故研究其性腺分化機制對于進行性別控制， 從而提升其養殖效益有重要價值。研究發現， 其性別決定受遺傳和環境等因素影響[18]， 對處于性腺分化前的牙鲆， 經17β-雌二醇(E2)處理可使其分化成雌性， 經17α-甲基睪酮(MT)或者高溫處理則使其分化為雄性[19-20]。研究還顯示， 牙鲆成體腦中表達三種類型的gnrh[21]， 但其雌、雄個體組織及性腺分化中的差異表達特征尚未見報道。本文通過實時熒光定量PCR(qPCR)的方法，分析了三種gnrh在牙鲆雌、雄成體組織， 以及性腺分化前及分化過程中腦和性腺組織中的差異表達，以期為系統闡述GnRH在魚類性腺分化和發育中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗用魚及樣品采集

牙鲆成魚全長(total length， TL) (30±5) cm、體重(625±25) g， 購于青島南山市場， 在中國科學院海洋研究所水族樓魚缸內暫養3 d用于組織差異表達分析。取樣前先用60 mg/L MS-222麻醉。雌雄個體各取3尾， 每尾魚各取腦、垂體、性腺、胃、脾臟、腸、鰓、腎臟、頭腎、肝臟、心臟、眼睛和肌肉組織， 并立即放入液氮中凍存以用于總RNA提取。性腺形狀對稱， 發育正常， 卵巢呈橘紅色， 精巢呈乳白色， 性腺一半用于總RNA提取， 一半用Davison液固定， 通過組織切片HE染色鑒定性腺發育時期[22-23]。

牙鲆異質雌核發育誘導魚苗在威海圣航科技水產養殖場通過紫外照射和冷休克誘導培育獲得[24]，培育至1.2～1.5 cm TL時進行雌雄表型誘導。將魚苗隨機分配到E2、MT和對照3個組中， 每組200尾魚苗， 分別在3 個90 L養殖箱培育， 養殖水溫維持在19～21 ℃， 鹽度30‰， 溶氧5.8～6.2 mg/L， 每日全量更換過濾海水2～3次， 光周期為14 L： 10 D， 每日投喂3～4次餌料。對照組投喂常規商用餌料。E2和MT組分別投喂含有5 mg/kg 的E2和MT (Sigma， 美國)的商用餌料[23]， 該餌料配置方法為： E2和MT分別溶解于無水乙醇并均勻噴灑于餌料上， 放置黑暗條件下晾干。培育至魚苗達到10 cm TL后， 各實驗組改投喂常規餌料， 并培育至15 cm TL。在魚苗2、3、4、6和8 cm TL時， 各組分別隨機取3尾魚， 用40 mg/L MS222麻醉后， 取其腦和性腺組織， 并立即放入液氮中速凍后存放于–80 ℃保存， 用于RNA提取。當魚苗15 cm TL時， 每組取30尾， 用上述濃度MS222麻醉，分別采集性腺組織， 用3倍以上體積的Davison液固定， 用于組織切片HE染色分析性比[23]。

1.2 總RNA提取及反轉錄cDNA

采用 Trizol(Toroivd， 英國)提取總RNA， 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性， Nanodrop 2000(Thermo，美國)檢測其濃度及純度。使用反轉錄試劑盒HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(諾維贊，中國南京)， 并按其說明書將總RNA反轉至cDNA。

1.3 qPCR檢測gnrh的表達

采用qPCR方法， 檢測gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆成體組織及性腺分化期腦和性腺中的表達量。根據這些基因的cDNA序列(gnrh1、gnrh2和gnrh3的GenBank編碼號分別是DQ074693.1、DQ008580.1和DQ444281.1)， 使用Premier 5.0軟件設計相應的特異性引物(見表1)。qPCR反應體系為20 μL， 按照TB Green? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus)(寶日醫生物， 中國)的說明書配制。其反應程序為： 95 ℃ 30 s 預變性； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40 個循環。牙鲆β-actin作為內參基因[25]。使用qTOWER3G熒光定量PCR儀(Jena， 德國)進行擴增，每個樣品重復3次， 利用 2–ΔΔCt法計算目的基因相對表達量[26]。使用SPSS軟件(IBM SPSS， Armonk， 美國)中的單因素方差分析及 Dunnett's 檢驗， 分析組內和組間基因表達差異的顯著性(P＜ 0.05)。

表1 用于qPCR分析的特異性引物Tab. 1 Specific primers for gene expression analysis with quantitative polymerase chain reaction

1.4 牙鲆性別與性腺發育時期的鑒定

性腺組織固定 24 h 后， 用乙醇和二甲苯梯度脫水處理， 石蠟包埋后切片(厚度5～7 μm)， 蘇木精和伊紅(HE)染色， 乙醇脫水及二甲苯透明， 最后用中性樹膠封片。在顯微鏡(Leica DM LB2， 德國)下觀察切片， 判斷性別及性腺發育時期[23]， 對性腺分化各組樣品計算其性比。

2 結果與分析

2.1 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆雌、雄成體組織中的表達

用于gnrh1、gnrh2和gnrh3雌、雄成體組織差異表達分析的牙鲆， 經組織學鑒定， 雄性處于精巢Ⅲ期階段， 雌性處于卵巢Ⅱ期階段(圖1)。

利用qPCR技術， 對雌、雄成體腦、垂體、性腺、胃、脾臟、腸、鰓、腎臟、頭腎、肝臟、心臟、眼睛和肌肉組織中gnrh1、gnrh2和gnrh3表達進行分析。結果表明，gnrh1在雌、雄各組織中幾乎都有表達， 且在雌雄個體腦、垂體、腎臟、頭腎、肝臟和眼睛中表達較高， 在腎臟中雄性顯著高于雌性(P＜ 0.05)； 而精巢中的表達略高于卵巢， 只是沒有顯著性差異(圖2a)。gnrh2在雌雄肝臟以及雄性的腸、腎臟、頭腎、眼睛和肌肉中檢測到表達(圖2b)。gnrh3只在雄性的腎臟、眼睛和肌肉中檢測到微弱表達(圖2c)。

圖 1 牙鲆雌、雄性腺組織切片Fig. 1 Histological sections of the testis and ovary of Paralichthys olivaceus

圖2 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆雌、雄成體組織中的表達Fig. 2 Expression of gnrh1， gnrh2, and gnrh3 in the male and female adult P. olivaceus tissues

2.2 gnrh1、gnrh2和gnrh3在性腺分化期的表達

通過性腺組織切片觀察確定性別， 并由此獲得各實驗組的性比： E2、對照組雌性率均為100%， MT組雄性率為100%。

2.2.1 腦組織中的差異表達

qPCR分析結果顯示，gnrh1的表達水平隨著牙鲆性腺分化的進行呈現上升的趨勢， 顯示其在性腺分化過程中發揮作用； 在4 cm TL魚苗中， E2組中的表達顯著高于MT組， 也顯著高于對照組(P＜ 0.05) (圖3a)，該結果顯示gnrh1的表達在牙鲆卵巢腔出現的時期(4 cm TL)受E2調控。gnrh2表達水平在2 cm TL時， E2組顯著高于MT組(P＜ 0.05)， 也顯著高于對照組(P＜0.05)， 該結果顯示gnrh2的表達在牙鲆性腺分化啟動時期(2 cm TL)受E2調控； 自3 cm TL， E2和對照組的表達水平均開始出現下降趨勢(圖3b)， 顯示其可能在雌性性腺分化啟動時發揮作用。gnrh3在2 cm TL時，E2組和對照組的表達均顯著高于MT組(P＜ 0.05)；MT和E2組自6 cm TL開始下降， 三個組均在8 cm TL下降至最低(圖3c)， 顯示其可能在雌性性腺分化啟動和分化中發揮作用， 但在精巢分化啟動時作用較小。

圖3 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆性腺分化期腦中的表達Fig. 3 Expression of gnrh1， gnrh2， and gnrh3 in the brain of P. olivaceus during gonadal differentiation period

2.2.2 性腺組織中的表達

qPCR結果顯示，gnrh1在2 cm TL時， MT、E2和對照組中的表達均為最高水平， 此后在三個組中的表達均下降至較低水平(圖4a)。gnrh2也是在2 cm TL時， 三組中的表達均顯著高于后面時期(P＜0.05)(圖4b)。gnrh3在MT和E2組中的表達在2 cm TL時， 顯著高于后面時期(P＜ 0.05)(圖 4c)。在各組中gnrh1、gnrh2和gnrh3的表達均呈現隨著性腺分化的開始和進行而下降的趨勢， 顯示出它們在雌性性腺分化啟動期在性腺中發揮作用。

圖4 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆性腺分化期性腺中的表達Fig. 4 Expression of gnrh1， gnrh2， and gnrh3 in the gonads of P. olivaceus during gonadal differentiation

3 討論

在魚類中，gnrh主要表達于腦和垂體， 在其他組織中也有表達， 但在不同的魚種中呈現不同的表達模式。在大西洋鱈魚(Gadus morhua)中， 三種gnrh在組織內的表達較為廣泛， 其中gnrh1在卵巢、鰓、心臟、腸道和脾臟中高表達，gnrh2和gnrh3則在腦和卵巢中高表達[27]。在一齡雄性大菱鲆(Schophthalmus maximus)中，gnrh1的表達分布較gnrh2和gnrh3更為廣泛， 且在腦、垂體和性腺中呈現高表達的模式， 而gnrh2和gnrh3則只在腦中高表達， 在其他組織中的表達較為微弱[28]。房保海等[1]在性成熟牙鲆中的半定量PCR研究表明，gnrh1在腦、垂體、胃、脾臟、眼睛、肌肉、腸、卵巢和精巢中均表達，gnrh2則在腦、垂體、鰓、頭腎和卵巢中有表達。本研究所用牙鲆雌魚卵巢處于第Ⅱ期， 雄魚精巢處于第Ⅲ期。定量分析結果顯示，gnrh1的表達分布也呈現一個廣泛表達的模式， 主要在腦、垂體、腎臟、頭腎、肝臟和眼睛中高表達， 卵巢和精巢中則較微弱， 性別差異表達只在腎臟中出現； 其在成體腦中高表達與其在性腺分化期結束時腦中相對較高的表達結果一致。gnrh2和gnrh3均未在成魚腦、垂體和性腺中檢測到表達，且在其他組織中表達也很微弱， 在腦中未檢測到表達的結果與其在性腺分化期結束時腦中較低的表達結果一致。組織表達結果表明， 在卵巢Ⅱ期和精巢Ⅲ期的牙鲆成魚中， 對性腺發育起作用的主要是gnrh1。在性腺發育其他時期gnrh1, gnrh2和gnrh3在腦和垂體等各組織中的表達特征仍需進一步研究。

性腺分化是魚類雌雄性別表型形成的必經過程。孫鵬等[23]研究表明， 組織學水平上， 牙鲆在(1.25±0.13) cm TL時形成原始性腺， 然后在(3.8±0.17) cm TL出現卵巢腔， (6.35±0.34) cm TL出現輸精管結構，分別標志著雌、雄性腺分化的開始， 而到了(8.65±0.59) cm 和(7.6±0.86) cm TL時卵巢和精巢分別形成明顯的性腺結構， 標志著性腺分化的基本結束。據此，本文研究了牙鲆性腺分化啟動期(2 cm TL)， 性腺分化前期(3 cm TL)， 性腺分化期(4～8 cm TL)腦和性腺中gnrh1、gnrh2和gnrh3的表達。在腦中它們呈現不同的表達模式。腦中gnrh1在性腺分化過程中表達量持續上升，gnrh2在2 cm TL時有較高的表達水平， 隨后表達水平下降，gnrh3表達水平在4 cm TL前相對較高， 之后下降， 在8 cm TL時基本沒有表達。這些結果與軍曹魚(Rachycentron canadum)和鮐魚(Scomber japonicus)性腺分化期的研究不完全一致， 在這兩種魚中， 雌、雄魚腦中三種gnrh表達水平均呈上升趨勢， 這暗示不同魚種中三種gnrh對性腺分化的作用可能不同[12，29]。牙鲆gnrh1在4 cm TL、gnrh2和gnrh3在 2 cm TL 時， MT和E2組中的表達出現顯著差異， 且E2組表達水平均高于MT組， 這些結果提示， 腦中gnrh1與牙鲆性腺分化過程有關，gnrh2和gnrh3可能與性腺分化的啟動有關。gnrh調控性別分化的作用在斑馬魚(Danio rerio)中得到了直接證實，gnrh3缺失的斑馬魚在受精后18 d時雄性基因表達顯著上升且性腺分化方向向雄性偏移[30]。牙鲆三種gnrh在性腺分化前的原始性腺中表達水平較高， 在性腺分化過程中呈現下降趨勢， 這顯示性腺中3種gnrh的表達可能都與其分化的啟動有關。在雌性先熟的黃鱔性逆轉過程中，gnrh2及其剪接體gnrh2-sv表達水平則在初期升高， 并保持較高水平[12]， 這說明gnrh2及gnrh2-sv參與了黃鱔性逆轉過程中雄性性腺分化的啟動， 以及分化過程。有趣的是， 在雄性先熟的黑鯛性逆轉過程中， 3種gnrh在性腺中均有表達， 提示黑鯛性腺中gnrh在其性逆轉雌性性腺分化過程中發揮作用[31]。因此，gnrh在魚類的性腺分化中發揮作用， 只是具體作用時間及方式可能存在不同，有待于進一步的研究和比較。

4 結論

綜上所述， 牙鲆中gnrh1基因可能參與了其性腺分化的啟動、分化過程及其性腺發育的進行， 其gnrh2基因則主要參與了性腺分化的啟動，gnrh3基因主要參與了性腺分化的啟動和分化過程。這些研究結果對進一步明晰牙鲆性腺分化和發育機制提供了參考。