WEE2基因純合突變Lys195Asn導致受精失敗和女性不孕的家系分析

劉頓 陳創奇 蘇念軍 何天文 燕瑾 劉風華★ 張曦倩★

成功受精是人類生育的重要前提，而正常受精的基礎是獲能后的單倍體精子與成熟的單倍體卵子相互融合［1］。在輔助生殖（Assisted reproduction，ATR）治療中，成熟卵子經體外受精（In vitro fertilization，IVF）或卵胞漿內單精子顯微注射（Intracytoplasmicsperminjection，ICSI）后實現精卵融合，體外受精率通?？蛇_70%～80%［2］，然而仍有1%～3%的ICSI 周期出現低受精率（≤25%）或完全受精失?。?-4］。導致ICSI 周期低受精率或完全受精失敗的因素比較復雜，如卵子細胞核與細胞質成熟不同步，紡錘體異?；蛘呤侨狈β炎蛹せ钸^程中的一些關鍵酶等［5］。近年來，隨著基因檢測技術的發展與普及，一些由遺傳致病基因突變導致的受精障礙案例逐漸被報道，例如男性中PLCZ1基因突變導致卵母細胞激活失?。?-8］，女性中WEE2基因突變導致卵子授精后無法形成原核等［9-11］。WEE2基因（WEE1同源體，也稱為WEE1B）屬于母源基因，僅在卵巢的卵母細胞中高表達。在小鼠GV 期卵子中降調Wee2基因表達后，小鼠卵母細胞能夠完成減速第一次分裂后排出極體，由MI 卵子發育至PB1 卵子，但通過IVF受精后，卵子不能形成原核，表現為受精障礙［12］。由此可見WEE2基因在卵母細胞受精過程中發揮至關重要的作用。本研究中應用全外顯子組測序技術對一受精失敗家系進行了遺傳學病因的鑒定，發現該案例中女性WEE2基因純合錯義突變是導致其反復ART 失敗的原因，并通過家系研究進一步闡明了WEE2基因型與表型的關系。

1 材料與方法

1.1 患者資料

夫婦2017年7月首次就診于本院生殖醫學中心時女方27 歲，男方26 歲。女方雙側輸卵管通暢，其余婦科檢查基本正常。男方精液檢查參數基本正常（密度：54.2×106/mL，前向運動比率：66.4%，活率：72.5%，正常形態率：4.8%）。臨床診斷為不明原因的原發不孕癥，不孕年限為3年?；颊叻驄D通過ART 治療反復失敗，主要表現為不孕和受精障礙。本研究通過了廣東省婦幼保健院醫學倫理委員會審查批準，同時征得了患者及其家人遺傳基因分析的知情同意。

1.2 控制性促排卵方案和體外受精

根據患者年齡、體重、激素水平及卵巢儲備情況選擇相應的經典促排卵方案。取卵、精液處理、體外授精、人工卵母細胞激活（Intracytoplasmicsperminjection，AOA）和胚胎培養技術均采用標準方法［13］。

1.3 遺傳基因分析

采集夫婦雙方及女方父母和哥哥的外周血，采用傳統的酚氯仿方法提取基因組DNA 用于遺傳分析。首先，根據標準實驗方法對夫婦雙方進行全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES）：基因組DNA 經片段化、末端修復、3'端加A 尾、連接測序接頭、PCR 擴增，使用雜交捕獲方法制備DNA 文庫，然后使用Illumina NovaSeq 高通量測序平臺進行全外顯子組的測序。隨后，對下機數據進行后續的生物信息學分析，包括將原始的FASTQ 格式文件與人類基因組hg19（GRCh37）參考序列進行比對；對短序列變異的檢出、過濾和注釋；分別應用PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）和Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org）蛋白質預測軟件對變異的有害性進行預測；利用人類外顯子組數據庫ExAC（http：//exac.broadinstitute.org/）和基因組變異頻率數據庫gnmoAD（http：//gnomad.broadinstitute.org/）查找突變位點頻率，用人類基因突變數據庫HGMD（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/）查詢突變是否被收錄；應用Clustal Omega 軟件通過比對不同物種蛋白序列，分析變異位點在不同物種之間的保守性。最后，對潛在的致病基因突變進行Sanger 測序驗證以及進一步的家系驗證和表型分析。

2 結果

2.1 臨床結果

不孕癥夫婦雙方通過ART 助孕過程和結果總結如下：3 個周期B 超監測排卵指導同房后未妊娠；兩人工授精（Artificial insemination of husband's sperm，AIH）周期未妊娠；1 個IVF 周期低受精率，無可移植胚胎；1 個ICSI 周期完全受精失??；1 個ICSI-AOA 周期完全受精失敗。體外授精的具體臨床實驗結果見表1。在ICSI-AOA 治療周期中，1 個卵子授精后出現了第二極體，但無法形成原核和進一步卵裂（見圖1）。

表1 患者ART 治療中的臨床表型Table 1 Clinical genotypes of the affected couple

2.2 全外顯子組基因測序、Sanger 測序驗證和家系分析

男方全外顯子組基因測序未找到與受精障礙相關致病基因變異。女方測序發現一個與受精障礙高度相關的基因變異WEE2（NM_001105558）：c.G585C（p.K195N）純合錯義突變（圖1）。蛋白預測軟件PolyPhen-2 和MutationTaster 的算法預測均提示該變異為有害突變。通過對先證者家系分析和Sanger 測序驗證發現該患者WEE2純合突變分別遺傳至患者無癥狀的父親（I-1）和母親（I-2），先證者的哥哥（Ⅱ-2）與先證者一樣發生了WEE2基因突變純合突變。氨基酸保守性分析表明，WEE2 蛋白第195位氨基酸Lys 在不同物種間高度保守。見圖2。

圖1 授精后觀察正常合子和患者卵子的形態學變化Figure 1 Morphology of a normal zygote and a affected individual oocyte after ICSI-AOA

圖2 先證者家系Sanger 測序結果和WEE2 蛋白（p.K195N）不同物種氨基酸序列Figure 2 Sanger sequencing results of proband family and WEE2（p.K195N）amino acid sequence of different species

3 討論

人類正常受精過程需要經歷一系列的生化過程，包括精子獲能，頂體反應，精卵結合，精卵質膜融合，卵子激活，完成第二次減速分裂，雌、雄原核形成和融合［1，14］。ART 周期中完全受精失敗并不十分常見，僅有1%～3%的ICSI 周期出現低受精率（≤25%）或完全受精失?。?-4］。由于倫理和研究技術的限制，目前ICSI 完全受精失敗的分子機制并不完全清楚，且難于改善和治療。遺傳學因素導致的受精失敗中，由于男性PLCZ1基因突變或圓頭精子癥導致卵母細胞激活失敗，可以通過ICSIAOA 技術進行治療改善［6-8］，而女性的遺傳學因素導致的受精障礙，臨床上尚無良好的補救措施。

本研究通過WES 技術鑒定了WEE2（NM_001105558）：c.G585C（p.K195N）純合錯義突變導致ART 周期中受精失敗和女性不孕的家系。Poly-Phen-2 和MutationTaster 軟件的算法預測該突變為有害變異，且通過檢索人類外顯子組數據庫ExAC和基因組變異頻率數據庫gnmoAD 發現該變異頻率為0，目前人類基因突變數據庫HGMD 尚未收錄該突變。根據Sanger 測序驗證和隨后的家系分析，發現先證者父母均為無癥狀的WEE2雜合突變攜帶者，說明疾病的遺傳方式符合孟德爾常染色體隱性遺傳，女性雜合子攜帶者不致病。此外，由于WEE2基因是母源基因，在卵母細胞中高度特異性表達，因此一般推斷WEE2純合雜合突變可能不影響男性生育力。本研究結果證實了WEE2基因純合突變僅僅會導致女性不孕，并不影響男性生育。這也是目前世界上首個報道WEE2基因純合突變的男性案例。目前對于該類患者，王磊教授研究團隊通過向WEE2突變的卵母細胞中注射野生型WEE2-cRNA進行治療［9］，拯救實驗結果顯示注射后的卵子能正常形成原核并受精，且能進一步培養后發育至囊胚階段，但是由于生物安全方面因素考慮，研究者并未移植囊胚到患者子宮，此項技術還無法應用到臨床治療當中，因此對于此類患者一旦明確了基因突變診斷結果，推薦直接采用供卵進行治療。

近年來，越來越多的遺傳基因突變被證明與ART 周期中卵子和胚胎異常有關，從而導致女性不孕。例如，TUBB8和PATL2基因突變導致女性卵子成熟障礙［15-17］，ZP1/ZP2/ZP3基因突變導致卵子透明帶異?；蚩章雅菥C合征［18］，PADI6基因突變導致胚胎早期發育阻滯［19］，WEE2［9-11］和TLE6［20］基因突變導致受精障礙和PANX1基因突變導致卵子死亡［21］等。WES 技術適合于ART 周期中各種極端異常表型的遺傳學病因的確診和研究，為患者進一步的助孕治療提供合理指導。本研究中WEE2基因突變家系完整的展示了WEE2基因型、表型以及性別的關系，為ART 周期中低受精率和完全受精失敗的分子診斷和遺傳咨詢提供了理論依據。