NLRP3-ASC-Caspase-1 信號通路在慢性心力衰竭患者外周血單核細胞中的表達

朱飛宇，徐慶梅，朱 建，湯 陽，高 琴，唐 碧，康品方，王洪巨

（蚌埠醫學院 1.第一附屬醫院心血管科，2.心腦血管疾病基礎與臨床重點實驗室，3.生理學教研室，安徽 蚌埠 233000）

心力衰竭（HF）是由于心臟功能的各種結構或功能受損導致無法在正常充盈壓下維持心輸出量所致［1，2］。隨人口老齡化及城鎮化進程的加速，中國心血管病呈明顯上升趨勢，且心力衰竭發病率高、預后差，年病死率高達40%［3］，慢性心力衰竭已成為重大公共衛生問題.導致慢性心力衰竭患者死亡的主要病種變化趨于一致，我國和歐美國家均以冠心病和/或高血壓為主。

有大量研究表明，人類和動物模型中的慢性心力衰竭與炎癥有關［4］。心力衰竭中的無菌炎癥是由危險相關分子模式（DAMPs）引發的，并已被證明可導致不可逆的心肌病變，例如纖維化，細胞凋亡和肥大［5-7］。DAMPs 激活Toll 樣受體引起通常包括核因子κB，Toll 樣受體4 信號和誘導炎性趨化因子，細胞因子的表達進而招募中性粒細胞、巨噬細胞和T 細胞。雖然這一過程最初在防止進一步的組織損傷方面起到有益的作用，但如果持續，就會導致慢性炎癥。心臟壓力的升高和不良的泵功能直接觸發炎癥細胞的活化，例如外周單核細胞，這些細胞在心臟中聚集并釋放到循環中［8，9］。人PBMCs 包括單核細胞及淋巴細胞，是慢性炎癥的重要參與者，能分泌包括IL-1β 和TNF-α 等在內的多種細胞因子和化學介質，介導炎癥的發生和發展。

NLRP3 炎性小體是一種細胞內相互作用蛋白的復合物，可識別DAMPs 并觸發促炎細胞因子的成熟，從而引發和增強炎癥反應［10-12］。NLRP3 炎性小體由核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）樣受體，細胞凋亡相關斑點樣含有胱天蛋白酶募集結構域蛋白（ASC）和半胱天冬酶組成。炎性體的形成導致半胱天冬酶-1（Caspase-1）活化。Caspase-1 進一步切割各種底物，包括細胞因子白介素-1β 前體和白介素-18 前體［13］。IL-1β 是一種具有多種生物活性的前炎性因子，而白介素-18 是新近發現的細胞因子，由PBMCs 及脾細胞等產生［14］，NLRP3 炎 性小體還可以caspase-1 依賴性方式誘導細胞凋亡［15］。通過細胞凋亡引起的心肌細胞損失減少了收縮儲備，導致心力衰竭的發展［16］。在NYHA Ⅲ級和Ⅳ級患者，EF 降低（＜40%）的患者心肌組織中，發現急性心肌炎患者的樣本中含有更多的含炎性小體的白細胞［17］。雖然僅存在關聯性，并沒有顯示因果關系，但是在受損和受壓的心肌細胞中不斷增加的炎性小體，提示其在心力衰竭的發病機理和惡化中起了重要作用。盡管NRLP3 炎性體與慢性心力衰竭的發生有關，但不良的心肌重塑機制尚不完全清楚。有必要做進一步的工作來闡明心力衰竭的發病機理和惡化的心肌重塑和修復機制。

因此，本研究旨在通過深入探討PBMCs 上NLRP3 炎癥體通路參與慢性心衰發生的分子機制，進一步揭示NLRP3 炎癥體通路與慢性心衰之間的信號網絡，可能有助于對這一特殊疾病分子機制的認識，并且為治療和改善預后提供新方法和新策略，具有重要的科學價值和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年10 月～2019 年12 月在本院接受治療的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級慢性心衰患者（NYHAⅡ～Ⅳ級）各20 例為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，慢性心力衰竭根據2018 年中國心力衰竭治療和診斷指南診斷［18］。臨床癥狀為急性感染、嚴重腎功能衰竭（血清肌酸水平＞3 mg/dL）或類風濕性疾病，或懷疑有惡性或原發性消瘦障礙的患者被排除在本研究之外。選擇20 名健康人為對照組。本研究參與者年齡為41～84 歲，本研究經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會（中國蚌埠）批準，并獲得所有受試者的書面知情同意。各組間年齡、性別、血糖水平、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、尿酸（UA）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑

人外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技 有 限 公 司）；NLRP3 抗 體（Abcam 公 司lot：GR3192189-4）；ASC、Caspase-1 抗 體（Novus Biologicals 公 司CAT#DF6148，CAT#VF6304）；β-actin 抗體（protintech 公司Cat #20536-1-AP）；免疫磁珠試劑盒（STEMCELL Technologies 公司lot#19D1011661）；Trizol 試劑、熒光定量檢測試劑盒、第一鏈合成試劑盒（TIANGEN 公司CAT#DP405-02，CAT#FP205-02，CAT#KR106-02）；引物（上海生工生物工程有限公司），序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 實驗方法

1.3.1 標本準備與PBMCs 分離 標本準備：通宵禁食后的清晨采集所有患者的外周血置于EDTA抗凝管中，2 h 內以2 500 r/min 離心15 min，取離心后的上層血漿，血漿于-80 °C 保存。

PBMCs 分離：（1）在15 mL 離心管加入淋巴細胞分離液（稀釋血∶淋巴細胞分離液=1∶1）；（2）用生理鹽水將抗凝血稀釋1 倍，充分混勻。緩慢加至淋巴細胞分離液層面上（將裝有淋巴細胞分離液的離心管傾斜，緩慢注入稀釋血，切勿沖散破壞液面分層），以2 000 r/min 離心20 min. 離心機溫度為20～25 ℃。（3）用移液管插到PBMC（云霧層混濁帶）層，沿管壁輕輕吸出此層細胞，把灰白色淋巴細胞層加入15 mL 離心管中并向該管加入生理鹽水至10 mL 重懸細胞；（4）4 ℃、3 000 r/min 離心7 min，棄上清，加入紅細胞裂解液重懸細胞，裂解5 min 后，4 ℃、1 500 r/min 離心10 min，再補滿生理鹽水繼續離心10 min。棄上清，繼續補滿生理鹽水繼續1 500 r/min 離心10 min。棄上清；（5）4 ℃、4 000 r/min 離心5 min。用移液槍吸出殘留液體，加入配置好的血清（胎牛血清∶二甲基亞砜=9∶1）重懸細胞，轉移至凍存管。-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 qRT-PCR 檢測NLRP3 通路相關基因在PBMCs 中的表達水平 使用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，根據miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（TIANGEN，cat.KR211）說明書將RNA 轉化為cDNA，根據miRNA 熒光定量檢測試劑盒（TIANGEN，cat.FP411）說明書進行熒光定量。用β-actin進行校正，以正常組作為對照，用2-ΔΔt法進行相對數據處理，計算炎癥相關基因的表達率。

1.3.3 Western blot 檢測NLRP3 通路相關蛋白在PBMCs 中的表達情況 使用前期提取的PBMCs，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量法（參照試劑盒說明書操作）測定各組蛋白濃度，加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。每組取50 μg 蛋白，10% SDS-PAGE 電 泳（60 V，30 min；90 V，100 min）；轉膜（200 mA，2～3 h）至PVDF 膜；5%脫脂牛奶室溫封閉4 h（或4 ℃過夜）；一抗室溫孵育4 h（或4 ℃過夜）；TPBS 洗滌3 次，10 min/次；二抗室溫孵育2 h；TPBS 洗滌3 次，10 min/次；ECL 發光試劑盒發光，凝膠成像系統獲取圖像。

1.3.4 ELISA 法檢測各組血漿中IL-1β 水平 根據生產商說明，使用ELISA 法測定血漿中IL-1β 水平，每組另設3 個復孔，使用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度值，根據標準曲線計算相應樣品中IL-1β 的含量。

1.4 統計學處理

數據使用Graphad prism6 軟件進行分析，結果用（±s）表示，采用單因素方差分析、q檢驗和卡方檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.2 流式細胞術鑒定人PBMCs

結合CD14+抗體的人PBMCs 經磁珠提純后，使用分選型流式細胞儀進行鑒定，得到的受試者PBMCs 純度大于90%。見圖1。

圖1 CD14+人外周血單核細胞鑒定Fig 1 Flow cytometric identification of CD14+ monocytes in each group

2.3 受 試 者PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1的mRNA 表達情況

qRT-PCR 檢測結果顯示，與對照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組以上指標表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅳ組以上指標表達水平升高。見表2。

表2 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表達情況（n=20，±s）Tab 2 mRNA expression levels of NLRP3，ASC，and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

表2 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表達情況（n=20，±s）Tab 2 mRNA expression levels of NLRP3，ASC，and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

組別對照組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組FP NLRP3 1.000±0.067 1.913±0.108 2.711±0.212 3.514±0.127 191.458＜0.000 1 ASC 1.000±0.123 1.435±0.097 1.854±0.092 2.131±0.069 77.71＜0.000 1 caspase-1 1.000±0.585 1.436±0.108 2.046±0.274 2.880±0.155 32.46＜0.000 1

2.3 受 試 者PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白的表達水平

Western blot 檢測結果顯示，與對照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋 白的表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組以上指標表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅳ組以上指標表達水平升高。見表3、圖3。

圖3 PBMCs 中NLRP3，ASC，caspase-1 蛋白的表達水平Fig 3 Expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in PBMCs

表3 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白的表達水平（n=20，±s）Tab 3 Expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

表3 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白的表達水平（n=20，±s）Tab 3 Expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

組別對照組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組F P NLRP3 0.315±0.150 0.699±0.119 1.019±0.118 1.296±0.134 52.18＜0.000 1 ASC 0.303±0.110 0.507±0.123 0.754±0.106 1.103±0.195 43.54＜0.000 1 caspase-1 0.433±0.130 0.637±0.139 0.896±0.150 1.259±0.221 37.77＜0.000 1

2.4 外周血漿中IL-1β 含量

ELISA 檢測結果顯示，與對照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組IL-1β 表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組IL-1β 表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅳ組IL-1β 表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 PBMCs 中IL-1β 的表達水平（n=20，±s）Tab 4 Expression levels of IL-1β in PBMCs（n=20，±s）

表4 PBMCs 中IL-1β 的表達水平（n=20，±s）Tab 4 Expression levels of IL-1β in PBMCs（n=20，±s）

組別對照組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組FP IL-1β 44.63±7.206 51.46±8.030 57.64±6.131 63.76±7.092 26.39＜0.000 1

3 討論

慢性心臟病與持續低級炎癥反應相關，其促進心臟不良重塑，并與疾病進展相關［19，20］。心力衰竭是入院的最常見原因，這迫切需要增加對慢性心臟病的無菌性炎癥的理解，以便為其治療干預提供新途徑。越來越多證據表明，炎癥小體通過識別瀕死細胞釋放的危險信號，在促進無菌性炎癥中發揮關鍵作用，而NLRP3 炎癥小體可以調節慢性炎癥對內在宿主信號的反應［21］。NLRP3 與接頭分子“含有CARD 結構域的凋亡相關斑點樣蛋白”（ASC）寡聚化，以響應危險信號，如ATP、尿酸鹽和膜脂質［22，23］。NLRP3 和ASC 隨后招募半胱氨酸蛋白酶pro-caspase-1 生成稱為炎癥小體的caspase-1 激活平臺，炎癥小體的激活導致31 kDa 的白介素-1β 前體水解，裂解為17 kDa 的成熟形式，參與糖尿病等一系列慢性疾病的發病機制［24-28］。

研究表明血管緊張素轉化酶抑制劑、β 受體阻滯劑和醛固酮拮抗劑的對射血分數低的心力衰竭患者有益［29］，然而，這些患者的高死亡風險表明，神經激素的活化不能完全解釋心力衰竭的發展。心力衰竭中的炎癥細胞因子升高，并且它們的水平與心力衰竭的嚴重程度和預后相關［30］，這些細胞因子被認為可以調節心肌重塑、心肌肥大和細胞凋亡、收縮力下降、纖維化增加以及其他不利的結構變化［31-33］。最初的心力衰竭研究專注于單個細胞因子，但是，要揭示心肌重塑的病理生理過程，還需要進一步研究炎癥途徑和細胞因子激活的潛在機制。

IL-1β 是一種促炎細胞因子，在細胞增殖、分化和 凋 亡 等 細 胞 活 動 中 發 揮 作 用［34，35］。IL-1β 誘 導 心肌細胞肌漿網鈣泄漏，損害心肌收縮力［36，37］。IL-1β刺激一氧化氮的產生，循環誘導型一氧化氮合酶相應增加，導致心肌細胞凋亡和組織重塑［38］。IL-1β 在心力衰竭時升高，并與運動耐量差和缺血-再灌注損傷后的重構有關［39，40］。調節IL-1β 可減輕心肌增大和心室功能障礙。本研究發現Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清IL-1β 水平高于對照組（P＜0.05），Ⅲ組血清IL-1β水平高于Ⅱ組（P＜0.05），Ⅳ組血清IL-1β 水平高于Ⅲ組（P＜0.05），該結果提示IL-1β 可能參與了心力衰竭的發生發展。

本研究通過提取患者PBMCs 并檢測NLRP3、ASC 及Caspase-1 信號通路的表達情況發現，與正常組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組患者外周血NLRP3、ASC 及Caspase-1 mRNA 和蛋白質含量均升高（P＜0.05）。結合患者血清炎癥產物IL-1β 的結果可以得出結論，慢性心力衰竭的發生和發展可能與NLRP3-ASC-Caspase-1 信號通路誘導的炎癥活化有關。

總而言之，本研究發現慢性心力衰竭患者PBMCs 中NLRP3-ASC-Caspase-1 信號通路相關物質表達明顯升高并伴有炎癥活化，此外隨心力衰竭級別的加重其水平升高更加顯著。但不足之處是，本研究樣本量較小，存在一定的局限性，此外實驗未對PBMCs 中相關信號通路采取干預措施從而驗證通路誘導的炎癥在心力衰竭中的具體作用。因此下一步可能需要設計前瞻性及動物實驗進行探究進一步確認NLRP3 通路作用于慢性心力衰竭的具體機制。

作者貢獻度說明：

朱飛宇：進行實驗，整理數據，撰寫論文。王洪巨、康品方：對論文內容作出關鍵修正。徐慶梅：參與實驗設計。朱建、湯陽、高琴、唐碧：給與實驗思路指導。