基于網絡藥理學的烏梅抗結直腸癌機制研究

潘雨煙，羅夢雪，方霜霜，徐楚楚，蘇曉蘭，魏 瑋

（1. 中國中醫科學院望京醫院脾胃病科，北京 100102；2. 北京中醫藥大學研究生院，北京 100029；3. 功能性胃腸病中醫診治北京市重點實驗室，北京 100102）

結直腸癌是世界排名第三的惡性腫瘤，在世界癌癥死亡原因中排第四［1］。且近年來，結直腸癌在發展中國家的發病率顯著上升［2-4］，為我國造成了嚴重的健康負擔及經濟負擔［5，6］。中醫藥對于結直腸癌的認識歷史久遠，在整體觀念和辨證論治思想指導下能夠參與結直腸癌的全程治療，對于控制病情進展、減輕癌癥放化療不良反應、提高患者生存質量等方面具有明顯優勢，能夠在整體治療過程中起到至關重要的作用［7］。

烏梅（Fructus mume）為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.etZuce.的干燥近成熟果實，始載于《神農本草經》，性平，味酸、澀，歸肝、脾、肺、大腸經?！侗静輳男隆酚涊d其可澀腸斂肺，止血涌痰，消腫解毒，生津止渴，治久嗽瀉痢，血痢尤良。其化學成分主要包括萜類、甾醇類、黃酮類、糖類、生物堿等，具有抗菌、抗病毒性肝炎、抗腫瘤、抗氧化等作用［8］。徐超［9］用烏梅提取物對AOM-DSS 誘導的腸病癌變小鼠進行干預，結果發現，烏梅能夠預防腸道炎癌轉化，對于AOM-DSS 誘導的腸病可起到防止向腸癌轉化的作用。然而烏梅的成分較多，其抗結直腸癌的作用機制尚未得到揭示?；诖?，本文利用網絡藥理學方法搜集出烏梅中潛在的有效物質，并對抗結直腸癌作用靶點及藥理活性進行預測，建立藥物-靶標-疾病相互關系網絡并進行分析，揭示烏梅抗結直腸癌的潛在作用機制，為更深入的實驗研究提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 烏梅主要活性成分與靶點的搜集與篩選

利 用TCMSP 數 據 平 臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索烏梅所含的所有化學成分，通過口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 對所有化學成分進行篩選，并在TCMSP 平臺檢索主要活性成分的靶點，同時，借助Uniprot（http：//www.uniprot.org/）數據庫查找所得基因靶點的基本信息。限定物種為人，對靶點基因名稱進行校正，剔除沒有靶點的化學成分及多余的重復項。

1.2 烏梅抗結直腸癌潛在作用靶點的預測

以“Colorectal Cancer”為關鍵詞，通過Genecard數據庫、DisGeNET 數據庫檢索獲取結直腸癌相關靶點，與烏梅化學成分靶點映射，得到共同靶點作為烏梅抗結直腸癌潛在靶點，建立數據集。

1.3 烏梅相關活性成分-作用靶點網絡構建與分析

將烏梅的活性成分與抗結直腸癌的潛在靶點導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建烏梅抗結直腸癌的活性成分-作用靶標網絡。

1.4 烏梅抗結直腸癌相關靶標相互作用網絡構建與分析

將潛在靶點導入STRING 數據庫，物種選定為“homo sapiens”，獲得蛋白相互作用關系，設置信度分值大于0.7，隱藏無蛋白互作關系的靶點，以TSV格式保存結果。再將數據導入Cytoscape3.7.2 軟件進行可視化處理和分析。

1.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

采用在線分析系統DAVID 對烏梅抗結直腸癌的靶點進行GO（Gene Ontology）基因功能富集及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，設定閾值P＜0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程。

2 結果

2.1 烏梅主要活性成分與靶點的搜集與篩選

本研究通過TCMSP 數據庫共檢索到烏梅成分40 個，根據OB 和DL 參數篩選到生物活性成分8個，見表1。得到蛋白靶點194 個，通過Uniprot 數據庫統一命名并去重后，得到178 個靶點。

表1 烏梅活性成分信息Tab 1 Basic information of active components in Fructus mume

2.2 烏梅抗結直腸癌潛在作用靶點的預測

通過Genecards 和DisGeNET 數據庫中篩選出與結直腸癌相關的基因共11 085 個。為提高研究結果準確性，根據相關度大小取每個數據庫前300個靶點組建結直腸癌相關靶點數據庫，去重后得到513 個結直腸癌相關靶點。與烏梅活性成分178 個靶點取交集，得到58 個可能與烏梅抗結直腸癌相關的作用靶點，見圖1。

圖1 “烏梅-結直腸癌”基因映射Venn 圖Fig 1 Venn map of“Fructus mume-colorectal cancer”gene mapping

2.3 烏梅相關活性成分-作用靶點網絡構建與分析

通過Cytoscape3.7.2 軟件構建成分-作用靶標網絡，其中紅色節點表示烏梅的活性成分，黃色節點表示結直腸癌靶點，邊線表示兩者的相互作用關系，見圖2。

圖2 烏梅抗結直腸癌的活性成分-靶標網絡圖Fig 2 Chemical components and target networks of Fructus mume in the treatment of colorectal cancer

2.4 烏梅結直腸癌相關靶標PPI 網絡的構建與分析

在STRING 數據庫構建共有靶點的蛋白互作PPI 網絡，將數據導入Cytoscape3.7.2 軟件，利用軟件分析和處理，網絡中節點大小反應Degree 值的大小。按Degree 從高到低排序依次為：TP53、AKT1、MAPK8、JUN、MAPK1、TNF、EGF、IL6 等，見圖3、圖4。

圖3 STRING 平臺PPI 蛋白互作網絡Fig 3 PPI protein interaction network of STRING platform

圖4 靶標相互作用網絡Fig 4 Target interaction network

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在線平臺對烏梅抗結直腸癌的靶點進行富集分析，根據P＜0.05 確定對應的條目，通過OmicShare 平臺繪制氣泡圖。

GO 功能富集分析得到相關條目108 條。其中生物過程（biological process，BP）相關條目87 條，涉及DNA 損傷的內源性信號通路反應、基因表達正調控、細胞因子反應等方面：細胞組成（cellular nucleus，CC）相關條目7 條：細胞質、細胞外、細胞核、線粒體組成等；分子功能（molecular function，MF）相關條目14 條：蛋白質二聚體活化、生長因子活化、蛋白結合、轉錄因子結合等方面。生物學過程、細胞組成、分子功能3 個模塊分別生成的前10條相關條目信息，見表2、圖5～7。

表2 GO 功能富集分析Tab 2 GO functional enrichment analysis

圖5 GO 功能富集的BP 分析Fig 5 BP analysis of GO functional enrichment

圖6 GO 功能富集的CC 分析Fig 6 CC analysis of GO functional enrichment

圖7 GO 功能富集的MF 分析Fig 7 MF analysis of GO functional enrichment

KEGG 通路富集分析得到相關條目88 條，涉及癌癥信號通路、蛋白聚糖在癌癥中的信號通路、結直腸癌、p53 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路等，前20 條相關信息，見表3、圖8。

表3 KEGG 信號通路富集分析Tab 3 Enrichment analysis of KEGG signal pathway

圖8 KEGG 通路富集分析Fig 8 Enrichment analysis of KEGG pathway

3 討論

本研究結果顯示，烏梅中有多種活性成分可通過多個基因靶點、多信號通路對結直腸癌產生影響，本研究檢索出烏梅抗結直腸癌相關活性成分包括β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）等。槲皮素為一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種生理功能［10］，流行病學報告顯示，攝入富含槲皮素的食物可降低消化道腫瘤如胃癌及結直腸癌的發生風險［11，12］；其抗結直腸癌的作用可通過多種途徑和機制發揮，Zhou等［13］通過定量蛋白組學分析方法發現槲皮素可通過干擾CCND1 基因表達、誘導細胞增殖G1期阻滯、誘導細胞形態學改變等途徑在HepG2 細胞中發揮抗腫瘤活性。國外相關研究證實槲皮素作用于HT-29 結腸癌細胞后可提高p53 蛋白的表達水平，誘導HT-29 結腸癌細胞凋亡［14］。山奈酚具有良好的抗腫瘤作用，研究證實山奈酚對HCT-116、HCT-15、SW480 等大腸癌細胞具有較強的細胞毒性、抗氧化、抗增殖及凋亡作用［15］。β 谷甾醇具有抗腫瘤活性，研究表明其對乳腺癌、前列腺癌、及胰腺癌細胞均具有抑制作用［16-18］，β-谷甾醇還可減少結腸癌細胞PCNA 抗原的表達，通過清除活性氧誘導腫瘤細胞COLO320DM 凋亡，進而抑制結直腸癌的發生發展［19］。

根據本研究結果，烏梅作用于結直腸癌的關鍵靶 點 包 括TP53、AKT1、MAPK8、JUN、MAPK1、TNF、EGF 等。其中TP53 是編碼p53 的抑癌基因，可由于基因缺失等因素引起失活，進而使p53 蛋白功能受限，引起p53 通路功能紊亂，這種現象在人類腫瘤中常有出現，且在結直腸癌發生發展中具有關鍵作用［20］，已有研究表明，TP53 的剪接突變與結直腸癌患者生存預后較差相關［21］。通過實驗研究發現在大鼠體內聯合滅活TP53 和MIR34A 可增加IL6、PAI1 的水平，促進致癌劑AOM 誘導的結直腸癌的發生以及腫瘤的進展和轉移［22］。AKT1 為AKT 的一個亞型，研究發現，p-Akt1 在腸道腫瘤部位陽性率明顯高于正常腸道黏膜組織［23］。AKT1 的磷酸化激活可介導FoxO 下調cyclin D1、cyclin D2表達，促進細胞周期循環，進而促進腫瘤的發生發展；抑 制AKT1，則 有 較 強 的 抗 腫 瘤 作 用［24］。MAPK8 基因參與編碼JNK 蛋白激酶，該蛋白為MAPK 通路的一種亞家族，在大腸癌的發生發展中，MAPK 可調控大腸癌細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增 殖、侵 襲 與 轉 移［25］。c-jun 是JUN 基 因 的 一 種 蛋白，為結直腸癌的易感性基因，c-Jun 的表達與結直腸癌患者的生存預后相關［26］。表皮生長因子EGF能夠促進腫瘤細胞增殖，促進其浸潤和轉移，參與多種器官纖維化，研究表明，EGF 在結直腸癌組織中的表達明顯升高［27］。通過靶點預測，篩選出烏梅抗結直腸癌的主要靶點還有TNF、MAPK1、MYC、IL6、VEGFA、CCND1、CASP3 等基因，表明烏梅可通過多靶點抗結直腸癌。

本研究通過GO 富集分析和KEGG 通路富集分析發現，烏梅可能通過調控p53、HIF-1、TNF 等信號通路發揮抗結直腸癌的作用。抑癌基因p53 是一種公認的與腫瘤清除過程相關的基因，通過p53 磷酸化可激活促凋亡基因的轉錄，誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，從而發揮作用［28，29］。研究表明，p53 激活可通過上調CHOP 蛋白介導的DR4、DR5 的表達，增加促凋亡蛋白的表達和ROS 生成，從而增加TRAIL 介導的細胞凋亡［30］。此外，Xu 等［31］研究發現FOXD 3 可與p53 結合，增強其表達能力，從而誘導結直腸癌腫瘤細胞凋亡。缺氧誘導因子HIF-1 在低氧環境下表達增加，生成血管，提高能量代謝和氧運輸，維持腫瘤細胞穩定，從而使腫瘤細胞適應缺氧［32］。相關研究表明［33-35］，HIF-1α 在結直腸癌局部和轉移瘤中均有較高的表達，阻斷HIF-α 通路可減少糖酵解相關酶GLUT-1 和LDH-A 的表達，減少腫瘤細胞分泌的乳酸含量，從而起到抑制腫瘤細胞的作用。TNF-α 為腫瘤壞死因子，由腫瘤相關巨噬細胞分泌，可誘發慢性炎癥，從而促進腫瘤的侵襲發展［36］。研究表明［37，38］，TNF-α 可激活NF-κB 及AP-1，進 而 啟 動IL-8 及MMPa 的 表 達，上 調CD44V6 與透明質酸結合，促進腫瘤定植。通過實驗研究及臨床證據推測，以上信號通路可能在烏梅抗結直腸癌中發揮作用。

綜上，本文通過網絡藥理學的方法發現烏梅中β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等多種成分可作用于TP53、AKT1、MAPK8、JUN、EGF 等靶點，通過調節p53、HIF-1、TNF 等信號通路來發揮抗結直腸癌的作用，為進一步藥理研究及臨床應用提供了一定的理論基礎，烏梅能否成為治療腫瘤的藥物，還需要更多相關實驗研究及理論探討以明確。